الكشف عن الاستجابات الفسيولوجية من الخلايا العصبية الحسية في ذبابة الفاكهة

1. اعبر خط السائق Gal4 إلى ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة (ث. P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). اسمح للصليب بالنمو عند 25 درجة مئوية
   ملاحظه: يمكن أن يساعد توليد الذباب بنسخ متعددة من الجينات المعدلة وراثيا Gal4 أو UAS-GCaMP في تعزيز شدة إشارة الفلورسنت. أظهرت نسخة سابقة من الجين المعدل UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) شدة مضان ضعيفة جدا عند التعبير عنها تحت سيطرة برنامج التشغيل Gr68a-Gal4.
   1. اجمع الذباب البالغ المغلق حديثا وافصله حسب الجنس وقم برفعه عند 25 درجة مئوية
      ملاحظة: المستوى الأساسي لمضان GCaMP5G هو الأمثل في الذباب الذي يتراوح عمره بين 14 و 28 يوما. يمنع عزل الذباب عن طريق الجنس إمكانية التفاعلات الاجتماعية التي قد تؤثر على الاستجابات العصبية.
2. تخدير ذبابة تحت تيار خفيف من ثاني أكسيد الكربون₂.
3. قم بتوصيل الذبابة بغطاء زجاجي عن طريق وضع قطرة صغيرة من طلاء الأظافر أولا في وسط غطاء 0.17 مم. ضع ذبابة برفق على جانبها على قطرة طلاء الأظافر الشفاف وتأكد من أن الذبابة تغطي القطرة بأكملها.
4. قم بتنفيذ الخطوتين 1.5 و 1.6 تحت مجهر مجسم تشريح ، يستخدم عند تكبير 8X.
5. استخدم فرشاة رسم مبللة لتمديد مقدمة الذبابة. قم بتثبيت الساق الأمامية في موضعها عن طريق وضع شريطين رفيعين من الشريط اللاصق فوق الجزأين الرصغيين الأول والخامس (الشكل 1 أ). سيؤدي ذلك إلى كشف الأجزاء الرصغية T2-T4 للتصوير (الشكل 1 ب).
6. لتصوير الخلايا العصبية على خرطوم ، ضع شريطا رفيعا من الشريط اللاصق فوق منصة خرطوم لفضح الملصق (الشكل 1 ج ، د).
7. ارسم حاجزا مسعورا حول الذبابة باستخدام قلم PAP (بيروكسيداز - مضادات بيروكسيداز) لمنع المحلول من التدفق فوق سطح الغطاء. قم بالقياس في غضون 30 دقيقة من التركيب.

1. الروابط المحبة للدهون المخففة (مثل CH₅0₃ ، المستخدمة في هذه الدراسة) في محلول PBST (محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع Triton X-100): 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي Na₂HPO₄ ، 1.8 ملي KH₂PO₄ ، 0.1٪ Triton X-100 (v / v) ؛ درجة الحموضة 7.4.
   1. اصنع محلول مخزون 1 مجم / مل من الترابط باستخدام PBST. قم بإعداد جميع التخفيفات اللاحقة لمحلول المخزون باستخدام PBST.
      ملاحظه: اعتمادا على قابلية ذوبان الترابط محل الاهتمام ، قد تكون هناك حاجة إلى مذيبات مختلفة لإذابته. يصف الجدول 1 قابلية ذوبان CH₅0₃ في مذيبات مختلفة. على عكس المذيبات الأخرى ، لم يزيد PBST من التألق.

1. باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر، ضع 10 ميكرولتر من PBST على الأجزاء الرصغية.
   ملاحظه: تعمل هذه الخطوة على ترطيب الساق وتمنع الأجزاء الرصغية من الانجراف.
2. استخدم نظاما بصريا يحتوي على كاميرا ذات سرعة وحساسية كافية لتحقيق إشارة مضان جيدة بدقة زمنية عالية.
   ملاحظه: في هذه الدراسة ، استخدمنا مجهر ثنائي البؤر للقرص الدوار وكاميرا sCMOS (انظر قائمة المواد).
3. اختر الجزء الرصغي المحدد والخلايا العصبية المراد تصويرها. احصل على ثلاثة مداخن Z متحدة البؤر قبل التحفيز.
   1. من الناحية المثالية، استخدم إعدادات الاكتساب التي تكون سريعة بما يكفي للسماح بأقصى دقة زمنية مع الاستمرار في التقاط حجم الخلية بالكامل. أمثلة على إعدادات الاستحواذ هي: تعريض ضوئي 200 مللي ثانية ، تجميع 2 × 2 و 6 × 0.5 ميكرومتر مربع أقسام بصرية ، يتم التقاطها كل 2 ثانية
      ملاحظة: تم تصوير الأرجل المثبتة بنجاح لمدة تصل إلى 10 دقائق، على فترات 30 ثانية، مع عدم وجود تبييض ملحوظ لإشارة GCaMP. لأوقات تسجيل أطول، تأكد من تثبيت الأرجل بإحكام شديد في مكانها على الغطاء.
   2. قم بتحسين طاقة الليزر للحصول على أعلى إشارة إلى ضوضاء يمكن تحقيقها مع الحد الأدنى من التبييض الضوئي أثناء نظام التصوير بأكمله. بالنسبة للتجارب الموضحة هنا ، استخدم ليزر 491 نانومتر (100 ميغاواط) عند انتقال 30٪ لتصوير كل من الخلايا العصبية الذوقية Gr68a و ppk23 على الساقين والخرطوم. استخدم تجميع 2 × 2 للسماح بأوقات تعرض أقصر مع الاستمرار في تحقيق دقة مكانية كافية.
      ملاحظه: تم تحسين إعدادات طاقة الليزر للكشف عن التغيرات الفلورية التي تتراوح من 1.2 إلى 4.5 ضعف.
4. ماصة 10 ميكرولتر من محلول التحفيز على الأجزاء الرصغية. أضف 10 ميكرولتر أخرى من PBST لتجارب التحكم. احصل على الفور على 117 صورة ما بعد التحفيز.
   ملاحظه: يعتمد عدد صور ما بعد التحفيز التي تم الحصول عليها على الوقت المستغرق للوصول إلى الحد الأقصى للتغيير في التألق (حوالي دقيقتين).
   1. الخطوة الحرجة: عند سحب المحلول على المستحضر، لا تلمس الذبابة بطرف الماصة، لأن ذلك سيؤدي إلى خروج الساق الأمامية من موضعها.
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، استخدم مناور دقيق لوضع الشعيرات الدموية الزجاجية التي تحتوي على محفز بالقرب من الجزء الرصغي المراد تصويره بدقة. قم بتوصيل كميات محبوطة من التحفيز باستخدام موزع الحقن المجهري داخل الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

الشكل 1: تركيب ذبابة حية لتصوير الخلايا العصبية في مقدمة الساق أو خرطوم. (أ) تركيب الساق الأمامية: صورة 3.2X لذبابة ذكر حية ، تظهر الأرجل الأمامية مثبتة على الغطاء بشريط لاصق. (ب) تظهر صورة 40X للذبابة كل جزء من الأجزاء الرصغية (T1-5) ووضع الشريط فوق الجزء الرصغي الأول وعلى الجزء الرصغي الخامس. (ج) تركيب خرطوم: توضع قطعة من الشريط فوق المنصة لكشف طرف خرطوم. (د) يتم تثبيت طرف الماصة لإضافة التحفيز فوق الذبابة قليلا ولا يتلامس مباشرة مع المستحضر.

الجدول 1: ذوبان CH503 في مذيبات مختلفة. DMSO: ثنائي ميثيل سلفوكسيد. تم تخفيف محاليل الإيثانول والهكسان و DMSO باستخدام dH2O (v / v). اقتصرت قابلية ذوبان CH503 في 0.2٪ DMSO على 250 نانوغرام / مل فقط. كانت الزيادة في ΔF / F مع المذيب وحده مكافئة لتلك التي لوحظت عند التحفيز بالفرمون.