$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. الفيزيولوجيا الكهربية والتحفيز البصري الوراثي
- تحديد الخلية المستهدفة.
- ضع الشريحة في غرفة تسجيل مغمورة عند 34 درجة مئوية مملوءة بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) بمعدل 2 مل / دقيقة بواسطة مضخة تمعجية. شل حركة الشريحة باستخدام مرساة شريحة.
- تحت هدف التكبير المنخفض (4x) لمجهر واسع النطاق باستخدام إضاءة الأشعة تحت الحمراء المائلة ، انتقل إلى القشرة المخية الداخلية الجانبية (LEC) الطبقة 5. قم بقياس المسافة من سطح اللوحة إلى الطبقة المطلوبة.
ملاحظه: تم تحقيق إضاءة الأشعة تحت الحمراء المائلة عن طريق وضع مصباح LED شبه أحمر بالأشعة تحت الحمراء على بعد حوالي 3 مم أسفل غطاء غرفة التسجيل بزاوية ~ 55 درجة على مستوى زلة الغطاء (الشكل 1 ب). تباين التداخل التفاضلي هو تقنية تصوير بديلة وشائعة الاستخدام للفيزيولوجيا الكهربية للشرائح.
- قم بالتغيير إلى هدف الغمر في الماء عالي التكبير (40x) وحدد الخلايا العصبية الهرمية. حدد موضع الخلية على شاشة الكمبيوتر بشريط لاصق.
ملاحظه: تحتوي الخلايا العصبية الهرمية على مورفولوجيا مثلثة تقريبا مع تشعبات قمية بارزة باتجاه سطح الشريحة (الشكل 2 أ). يمكن تقييم صحة الخلية من خلال عدم وجود نواة مكثفة ومرئية وفحص غشاء البلازما الذي يجب أن يبدو سلسا. من غير المحتمل أن يكون وضع العلامات الفلورية الواضحة للمحاور بواسطة بروتين اندماج opsin-fluorophore مرئيا عند استخدام مجهر مضان واسع المجال. لتصور الإسقاطات المحورية ، قم بإجراء الكيمياء النسيجية المناعية اللاحقة باستخدام جسم مضاد أولي ضد فلوروفور opsin وتضخيمه بجسم مضاد ثانوي مترافق مع فلوروفور من نفس الطول الموجي أو ما شابه.
- تشكيل مشبك التصحيح الخلية الكاملة.
- قم بتصنيع ماصة زجاجية من البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة واملأها بمحلول تسجيل مفلتر داخل الخلايا (120 ملي مولار ك.غلوكونات ، 40 ملي مولار HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) ، 10 ملي مولار KCl (كلوريد البوتاسيوم) ، 2 ملي مولار كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، 2 ملي مولار MgATP (أدينوزين ثلاثي الفوسفات) ، 1 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم (كلوريد المغنيسيوم) ، 0.3 ملي مولار NaGTP (ثلاثي فوسفات جوانوزين الصوديوم) ، 0.2 ملي مولار EGTA (حمض رباعي أسيتيك جلايكول الإيثيلين) ، و 0.25٪ بيوسيتين مصنوع في UPW (ماء عالي النقاء) ، درجة الحموضة 7.25 ، 285-300 ملي أسم). ضع الماصة الدقيقة المملوءة في حامل القطب الكهربائي على منصة رأس مضخم التصحيح ، مما يضمن اتصال سلك القطب بالمحلول داخل الخلايا.
- قم بالضغط الإيجابي عن طريق الفم عن طريق النفخ بقوة في قطعة الفم (مثل حقنة سعة 1 مل مع إزالة المكبس) متصلة عن طريق الأنبوب بالمنفذ الجانبي لحامل القطب الكهربائي وحافظ على الضغط عن طريق إغلاق صمام ثلاثي الاتجاهات في الخط. ارفع هدف المجهر بحيث يتشكل الغضروف المفصلي وأدخل القطب الكهربائي في الغضروف المفصلي حتى يمكن رؤيته على المجهر.
- افتح نافذة اختبار الختم في WinLTP16 (أو أي برنامج اقتناء/راسم الذبذبات الآخر)، وباستخدام مكبر الصوت في وضع مشبك الجهد، قم بتطبيق نبضة مربعة 5 مللي فولت لتحديد ما إذا كانت مقاومة الماصة هي 3-6 MΩ أم لا.
- اقترب من الخلية المحددة ولمسها بطرف الماصة؛ يجب أن يؤدي ذلك إلى حدوث فجوة في غشاء الخلية (الشكل 2 أ؛ اللوحة اليمنى) وزيادة طفيفة في مقاومة الماصة (0.1 ميجا أوم).
- حرر الضغط الإيجابي واضغط السلبي عن طريق تطبيق شفط معتدل في قطعة الفم ؛ يجب أن يؤدي ذلك إلى زيادة كبيرة في مقاومة الماصة (>1000 MΩ). يمكن الآن ترك الضغط محايدا. قم بتطبيق الضغط السلبي في منحدر متزايد تدريجيا حتى يتمزق غشاء الخلية مما يؤدي إلى عابرات سعة الخلية بأكملها.
- سجل الأحداث المشبكية التي تم استحضارها بصريا.
- أدخل تكوين المشبك الحالي.
ملاحظة: في معظم الحالات ، يكون الانتقال المشبكي بعيد المدى غلوتاماتيرجيا ، وبالتالي فإن التسجيل في إمكانات الغشاء القريبة من إمكانات انعكاس الكلوريد سيؤدي إلى عزل الانتقال بوساطة مستقبلات AMPA (AMPAR) بشكل أفضل وتقليل قياس أي تثبيط للتغذية الأمامية (FFI) يتم استحضاره. يعتمد انعكاس الكلوريد على تكوين محلول التسجيل داخل الخلايا و aCSF ويمكن حسابه باستخدام معادلة Goldman-Hodgkin-Katz. بالنسبة للحلول المذكورة أعلاه ، كان هذا -61.3 مللي فولت. كان للخلايا العصبية الهرمية من الطبقة 5 LEC متوسط إمكانات غشاء الراحة -62 مللي فولت ، وعند الضرورة ، تم الحفاظ عليها عند هذه الإمكانات عن طريق حقن تيار مستمر. بدلا من ذلك ، يمكن تثبيت الخلايا بالجهد إلى الإمكانات المطلوبة. لتسجيل الإسقاطات المثبطة بعيدة المدى16 أو لتسجيل FFI ، مشبك الجهد عند إمكانية انعكاس الكاتيون لعزل توصيل كلوريد GABAergic. عندما تكون الخلايا العصبية لقط الجهد عند إمكانات الغشاء أعلى من عتبة جهد الفعل ، يتم استخدام محلول داخل الخلايا قائم على السيزيوم يحتوي على حاصرات قنوات الصوديوم ذات الجهد الكهربائي لتحسين مشبك الجهد ومنع بدء إمكانات العمل (130 ملي مولار CsMeSO4 (سيزيوم ميثانسلفونات) ، 10 ملي مولار HEPES ، 8 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار QX 314 كلوريد ، 4 ملي مولار MgATP ، 0.5 ملي مولار EGTA ، 0.3 ملي NaGTP ، 0.25٪ بيوسيتين مصنوع في UPW ، الرقم الهيدروجيني 7.25 ، 285-300 مللي أسم).
- باستخدام برنامج الحصول على البيانات ، أرسل إشارات منطق الترانزستور والترانزستور (TTL) إلى برنامج تشغيل LED (الصمام الثنائي الباعث للضوء) لتنشيط مصباح LED مركب 470 نانومتر. يتم توجيه مؤشر LED المركب إلى مسار ضوء المجهر باستخدام مكعبات الترشيح والبصريات المناسبة (الشكل 1 ب) لتطبيق نبضات الضوء على الشريحة عبر هدف 40x لاستحضار إمكانات ما بعد التشابك المثيرة البصرية الوراثية (oEPSPs).
ملاحظه: يمكن تطبيق نبضات الضوء بشكل محيط / فوق التشعبات ، مما يؤدي إلى تنشيط الأوبسين في المحاور والعروة قبل المشبكية ، أو يمكن للمحقق تحريك الهدف إلى المحاور بعيدا عن الخلية المسجلة لتجنب التحفيز المفرط للعروة. يعتمد الحد الأقصى لسعة oEPSP على قوة الإسقاط المشبكي وفعالية الحقن الفيروسي واستخدام الأوبسين يمكن معايرة oEPSPs إلى السعة المطلوبة عن طريق تغيير شدة الضوء و/أو مدته18؛ إن تغيير مدة نبضات الضوء (المدة النموذجية بين 0.2-5 مللي ثانية عند أقصى خرج طاقة LED ، مما ينتج عنه كثافة ضوء 4.4 ميجاوات / مم 19) يعطي اتساع oEPSP أكثر اتساقا من تغيير خرج الطاقة لمصباح LED.
- التحقيق في خصائص الإطلاق قبل المشبكي (التغيير في الجهد) عن طريق توصيل قطارات من نبضات ضوئية متعددة بفترات مختلفة بين التحفيز (الشكل 2 ه) ؛ يجب توخي الحذر أثناء تفسير الإرسال المستحث بصريا.
- تحقق من اللدونة طويلة المدى إما عن طريق استحضار oEPSPs19 بشكل متكرر أو تطبيق الروابط. راقب سعة oEPSP لمدة 5-10 دقائق لضمان الاستقرار قبل تحريض اللدونة ، ثم راقب حتى يتم الوصول إلى سعة مستقرة (عادة 30-40 دقيقة).
ملاحظه: معظم opsins الحالية غير قادرة على استحضار إمكانات عمل متعددة بشكل موثوق عند ترددات عالية ، على سبيل المثال ، 100 محفز يتم تسليمها عند 100 هرتز ، كما هو الحال عادة للحث على LTP.
- للتأكد من أن oEPSPs أحادية المشبك ، قم بإجراء تنشيط مفرط للمسار المحول عن طريق وضع الهدف فوق الشجرة المتغصنة والتحفيز في وجود 0.5 ميكرومتر من السموم الرباعية و 100 ميكرومتر أمينوبيريدين. سيؤدي تطبيق السموم الرباعية إلى إلغاء انتقال العدوى إذا كانت الاستجابات تعتمد على إمكانات الفعل ، وسيؤدي الإدراج اللاحق للأمينوبيريدين إلى استعادة العدوى جزئيا إذا تم إنشاء oEPSPs أحادي المشبك 19 ، 20.
- للسماح للبيوسيتين بملء الخلايا العصبية ، انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد الدخول إلى تكوين الخلية بأكملها. في مشبك الجهد ، مراقبة سعة الغشاء ومقاومة الإدخال.
- اسحب الماصة ببطء على طول زاوية الاقتراب بعيدا عن سوما الخلية، مع ملاحظة الاختفاء البطيء لعابرات السعة وتيار الغشاء، مما يشير إلى إعادة إغلاق غشاء الخلية وتشكيل رقعة خارجية للخارج عند طرف الماصة. لاحظ اتجاه الشريحة وموقع الخلية (الخلية) داخل الشريحة. ضع الشريحة في PFA (بارافورمالدهايد) في طبق 24 بئرا ، واحتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، ثم انقلها إلى 0.1 M PB.
ملاحظه: يمكن تخزين الشرائح لمدة تصل إلى أسبوع. إذا كانت هناك حاجة إلى تخزين أطول ، فقم بتغيير PB (مخزن الفوسفات) بانتظام أو استخدم PB المحتوي على أزيد الصوديوم (0.02٪ -0.2٪ من أزيد الصوديوم).
