تحميل وتفريغ صبغة FM بوساطة القطب الكهربائي الدقيق في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية

الملخص

المصدر: Kopke ، D. L. ، et al. ، FM صبغة التدوير في المشبب: مقارنة إزالة الاستقطاب العالي من البوتاسيوم ، والتحفيز الكهربائي والتحفيز الكهربائي ورودوبسين. J. Vis. إكسب. (2018)

< p class = "jove_content"> في هذا الفيديو ، ذبابة الفاكهة تغمر الألياف العصبية في صبغة FM ، التي ترتبط بدهون غشاء الخلية. يحفز قطب الشفط الدقيق والنبضات الكهربائية عملية الالتقام الخلوي ، ويدمج صبغة FM في حويصلات داخلية مشكلة حديثا. هذه الطريقة ، التي تصور مراحل ما قبل المشبكي للنقل العصبي ، مفيدة لدراسة الوظيفة المشبكية وإطلاق الناقل العصبي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تشريح غراء اليرقات

1. امزج جيدا 10 أجزاء من قاعدة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون مع جزء واحد من عامل معالجة المطاط الصناعي السيليكوني من مجموعة المطاط الصناعي.
2. قم بتغطية غطاء زجاجي مقاس 22 × 22 مم بالمطاط الصناعي وقم بمعالجته على لوح ساخن عند 75 درجة مئوية لعدة ساعات (حتى لا يصبح لزجا عند اللمس).
3. ضع غطاء زجاجي مطلي بالمطاط الصناعي في غرفة تشريح زجاج شبكي المصنوعة خصيصا لتشريح اليرقات.
4. قم بإعداد ماصات الغراء من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب قطب كهربائي دقيق قياسي للحصول على حجم الاستدقاق والطرف المطلوب.
5. قم بقطع طرف الماصة الدقيقة برفق، وإلى الطرف الآخر، قم بتوصيل 2 قدم من الأنبوب البلاستيكي المرن (1/32 بوصة القطر الداخلي، المعرف؛ 3/32 بوصة القطر الخارجي، OD؛ 1/32 بوصة، مع تركيب الفم (طرف الماصة P2).
6. استعدادا لتشريح اليرقات ، املأ وعاءا صغيرا (0.6 مل غطاء أنبوب Eppendorf) بحجم صغير (~ 20 ميكرولتر) من الغراء.
7. املأ الغرفة بالمحلول الملحي (بالملليمتر): 128 كلوريد الصوديوم ، 2 كيلو كلوريد ، 4 ملجمكلوريد_{2 ، 1} كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 70 سكروز ، و 5 2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-يل] حمض الإيثان سلفونيك (HEPES) الرقم الهيدروجيني 7.2.
8. أضف الجسم المضاد المضاد لبيروكسيداز الفجل الحصان (HRP) المقترن ب Alexa Fluor 647 (مضاد ل HRP: 647 ؛ خفف 1:10 من مخزون 1 مجم / مل) لوضع العلامات على الطرف المشبكي NMJ أثناء التشريح 21،22.
9. باستخدام فرشاة رسم دقيقة (مقاس 2) ، قم بإزالة الطور الثالث المتجول من قارورة الطعام وضعها على زجاج الغطاء المطلي بالمطاط الصناعي.
10. املأ طرف الماصة الدقيقة الزجاجية بحجم صغير من الغراء باستخدام ضغط الهواء السالب الناتج عن الفم مع الملحق (الخطوة 1.5).
11. ضع الجانب الظهري لليرقة لأعلى باستخدام ملقط وألصق الرأس على الغطاء المطلي بالمطاط الصناعي بقطرة صغيرة من الغراء باستخدام ضغط هواء إيجابي عن طريق الفم.
12. كرر هذا الإجراء مع الطرف الخلفي لليرقة ، مع التأكد من شد مشدودا بين مرفقي الغراء.
13. باستخدام المقص (شفرات 3 مم) ، قم بعمل قطع أفقي (~ 1 مم) في الخلف وقطع رأسي على طول خط الوسط الظهري.
14. باستخدام ملقط دقيق (# 2) ، قم بإزالة القصبة الهوائية الظهرية والأمعاء والجسم الدهني والأعضاء الداخلية الأخرى التي تغطي العضلات.
15. كرر إجراء اللصق للوحات جدار الجسم الأربعة ؛ قم بتمديد جدار الجسم برفق أفقيا ورأسيا.
16. ارفع الحبل العصبي البطني (VNC) باستخدام الملقط ، وقم بقطع الأعصاب الحركية بعناية بالمقص ، ثم قم بإزالة الحبل العصبي البطني تماما.
17. لإيقاف ركوب SV ، استبدل محلول ملحي بالتشريح بمحلول ملحي خال من Ca²⁺ (مثل محلول ملحي التشريح أعلاه بدون CaCl₂).

فئة < p = "jove_title" >2. التحفيز الكهربائي تحميل صبغة FM

1. قم بإعداد ماصة شفط باستخدام مجتذب القطب الكهربائي الدقيق للحصول على حجم الاستدقاق والطرف المطلوبين.
قم
2. بتلميع طرف القطب الكهربائي الدقيق بقوة دقيقة حتى يمكن امتصاص عصب حركي واحد بمقاس محكم.
3. حرك ماصة الشفط على حامل القطب الكهربائي الموجود على مناور دقيق وقم بتوصيله بالأنبوب البلاستيكي المرن الطويل والحقنة.
4. تعيين معلمات المحفز (على سبيل المثال ، 15 فولت ، تردد 20 هرتز ، مدة 20 مللي ثانية ، ووقت 5 دقائق أو 1 دقيقة.
5. استبدل المحلول الملحي الخالي من Ca^{2 +} في تحضير اليرقات بالمحلول الملحي FM1-43 أعلاه (4 ميكرومتر ؛ 1 ملي مولار CaCl₂) في جهاز الفيزيولوجيا الكهربية.
6. ضع المستحضر على مرحلة المجهر وارفع المسرح حتى يتم تركيز اليرقة وماصة الشفط (هدف الغمر في الماء 40X).
7. امتصاص حلقة من العصب الحركي المقطوع الذي يعصب الجزء النصفي المحدد بضغط هواء سلبي ناتج عن المحقنة في قطب الشفط.
8. اختبر وظيفة قطب الشفط بدفعة قصيرة من التحفيز أثناء المراقبة البصرية لتقلص العضلات في الجزء النصفي المحدد.
9. تحفيز العصب الحركي باستخدام المعلمات المحددة (الخطوة 2.4) لدفع الالتقام الخلوي SV وامتصاص صبغة FM1-43.
10. يغسل بسرعة باستخدام محلول ملحي خال من Ca²⁺ (5x لمدة 1 دقيقة) لإزالة محلول الصبغة FM1-43 تماما.
11. حافظ على مستحضر اليرقات في محلول ملحي طازج خال من Ca²⁺ للتصوير الفوري باستخدام بروتوكول التصوير متحد البؤر من الأعلى.
12. لاحظ بعناية صورة NMJ (الجزء والجانب والعضلة) لضمان الوصول إلى نفس NMJ بعد تفريغ صبغة FM.

المواد