مقالة منهجية

تحليل إعادة تدوير الحويصلة المشبكية وامتصاص الصبغة الفلورية في يرقات ذبابة الفاكهة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kopke ، D. L. ، et al. ، FM Dye Cycling at the Synapse: مقارنة إزالة الاستقطاب العالي من البوتاسيوم ، والتحفيز الكهربائي والتحفيز الكهربائي والقنال رودوبسين. J. Vis. Exp. (2018).

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لدراسة إعادة تدوير الحويصلة المشبكية عند التقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة التي تعبر عن القناة رودوبسين باستخدام صبغة فلورية. ينشط الضوء الأزرق القناة رودوبسين ، مما يتسبب في تدفق الكالسيوم وإفراز الحويصلة المتشابكة. تندمج الصبغة في الأغشية العصبية ويتم استيعابها أثناء الالتقام الخلوي ، مما يؤدي إلى تحسين التألق. يؤدي المزيد من تحفيز الضوء الأزرق إلى إفراز الخلايا وإطلاق الصبغة ، والذي يظهر من خلال انخفاض التألق.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تشريح غراء اليرقات

  1. امزج جيدا 10 أجزاء من قاعدة المطاط الصناعي السيليكوني مع جزء واحد من عامل معالجة المطاط الصناعي السيليكوني من مجموعة المطاط الصناعي (جدول المواد).
  2. قم بتغطية غطاء زجاجي مقاس 22 × 22 مم بالمطاط الصناعي وقم بمعالجته على لوح ساخن عند 75 درجة مئوية لعدة ساعات (حتى لا يصبح لزجا عند اللمس).
  3. ضع غطاء زجاجي مطلي بالمطاط الصناعي في غرفة تشريح زجاج شبكي مصنوعة خصيصا (الشكل 1 ، أسفل) استعدادا لتشريح اليرقات.
  4. قم بإعداد ماصات الغراء من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب قطب كهربائي دقيق قياسي للحصول على حجم الاستدقاق والطرف المطلوب.
  5. اقطع طرف الماصة الدقيقة برفق ، وإلى الطرف الآخر ، قم بتوصيل 2 قدم من الأنبوب البلاستيكي المرن (1/32 بوصة القطر الداخلي ، المعرف ؛ 3/32 بوصة القطر الخارجي ، OD ؛ 1/32 بوصة الجدار ؛ جدول المواد) مع تركيب الفم (طرف ماصة P2).
  6. املأ وعاءا صغيرا (غطاء أنبوب Eppendorf سعة 0.6 مل) بحجم صغير (~ 20 ميكرولتر) من الغراء (جدول المواد) استعدادا لتشريح اليرقات.
  7. املأ الغرفة بالمحلول الملحي (بالملليمتر): 128 كلوريد الصوديوم ، 2 كيلو كلوريد ، 4 ملجمكلوريد2 ، 1 كلوريدالكالسيوم 2 ، 70 سكروز ، و 5 2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-يل] حمض الإيثان سلفونيك (HEPES) الرقم الهيدروجيني 7.2.
  8. أضف الجسم المضاد المضاد لبيروكسيداز الفجل الحصان (HRP) المقترن ب Alexa Fluor 647 (مضاد ل HRP: 647 ؛ خفف 1:10 من مخزون 1 مجم / مل) لوضع العلامات على الطرف قبل المشبكي للوصلة العصبية العضلية (NMJ) أثناء التشريح.
  9. باستخدام فرشاة رسم دقيقة (مقاس 2) ، قم بإزالة يرقة الطور الثالث المتجولة من قارورة الطعام وضعها على زجاج الغطاء المطلي بالمطاط الصناعي.
  10. املأ طرف الماصة الدقيقة الزجاجية بكمية صغيرة من الغراء باستخدام ضغط الهواء السالب الناتج عن الفم مع الملحق (الخطوة 1.5).
  11. ضع الجانب الظهري لليرقة لأعلى باستخدام ملقط وألصق الرأس على الغطاء المطلي باللدائن بقطرة صغيرة من الغراء باستخدام ضغط الهواء الإيجابي عن طريق الفم.
  12. كرر هذا الإجراء مع الطرف الخلفي لليرقة ، مع التأكد من أن مشدود بين مرفقي الغراء.
  13. باستخدام المقص (شفرات 3 مم ؛ جدول المواد) ، قم بعمل قطع أفقي (~ 1 مم) في الخلف وقطع رأسي على طول خط الوسط الظهري.
  14. باستخدام ملقط دقيق (# 5 ، جدول المواد) ، قم بإزالة القصبة الهوائية الظهرية والأمعاء والجسم الدهني والأعضاء الداخلية الأخرى التي تغطي العضلات.
  15. كرر إجراء اللصق للوحات جدار الجسم الأربعة ، مع التأكد من تمديد جدار الجسم برفق أفقيا ورأسيا.
  16. ارفع الحبل العصبي البطني (VNC) باستخدام الملقط ، وقم بقطع الأعصاب الحركية بعناية بالمقص ، ثم قم بإزالة الحبل العصبي البطني تماما.
  17. استبدل محلول ملحي للتشريح بمحلول ملحي خال من Ca2 + (مثل محلول ملحي التشريح أعلاه بدون CaCl2) لإيقاف دورة الحويصلة المشبكية (SV).
< p class = "jove_title" >2. التصوير: الفحص المجهري متحد البؤر

  1. استخدم مجهر متحد البؤر المستقيم مع هدف الغمر في الماء 40X لتصوير مضان صبغة NMJ (يمكن استخدام مجاهر أخرى).
  2. صورة عضلة 4 NMJ من أجزاء البطن 2-4 (يمكن تصوير NMJs الأخرى) وجمع الصور باستخدام البرامج المناسبة (جدول المواد).
  3. استخدم ليزر HeNe 633 نانومتر لإثارة HRP: 647 (مع مرشح التمرير الطويل > 635 نانومتر) وليزر Argon 488 نانومتر لإثارة FM1-43 (مع مرشح ممر النطاق 530-600 نانومتر).
  4. تحديد الكسب والإزاحة الأمثل من الناحية التشغيلية لكلتا القناتين.
    ملاحظه: ستظل هذه الإعدادات ثابتة طوال بقية التجربة.
  5. خذ مكدس Z متحد البؤر عبر NMJ المحدد بالكامل من أعلى إلى أسفل الطرف المشبكي.
  6. لاحظ بعناية NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الفائض إلى نفس NMJ بالضبط بعد تفريغ صبغة FM.
فئة < ص = "jove_title" >3. تحميل صبغة FM تحفيز Channelrhodopsin

  1. ارفع اليرقات التي تعبر عن ChR2 على الطعام الذي يحتوي على الشبكية ذات العامل المساعد ChR2 (مذاب في الإيثانول ؛ تركيز نهائي 100 ميكرومتر).
  2. ضع مستحضر اليرقات في حجرة زجاج شبكي على مرحلة مجهر تشريح مزود بمنفذ كاميرا.
  3. قم بإرفاق مؤشر LED أزرق (470 نانومتر؛ جدول المواد) إلى محفز قابل للبرمجة باستخدام كابل متحد المحور ووضع مؤشر LED في منفذ الكاميرا.
  4. ركز شعاع ضوء LED الأزرق على وظيفة اليرقات المقطوعة باستخدام وظيفة التكبير المجهري.
  5. استبدل المحلول الملحي الخالي من Ca2 + على مستحضر اليرقات بمحلول ملحي فوق FM1-43 (4 ميكرومتر ؛ 1 ملي مولار CaCl2) في المرحلة البصرية الوراثية.
  6. اضبط معلمات LED باستخدام المحفز (على سبيل المثال ، تردد 15 فولت ، تردد 20 هرتز ، مدة 20 مللي ثانية ووقت 5 دقائق (الشكل 2)).
  7. ابدأ التحفيز الضوئي وتتبعه بمؤقت للمدة المحددة مسبقا لفترة التحفيز البصري الوراثي (على سبيل المثال ، 5 دقائق ؛ الشكل 2).
  8. عندما يتوقف المؤقت ، قم بإزالة محلول صبغة FM بسرعة واستبدله بمحلول ملحي خال من Ca2 + لإيقاف دورة SV.
  9. يغسل في تتابع سريع باستخدام محلول ملحي خال من Ca2+ (5x لمدة 1 دقيقة) لضمان إزالة محلول صبغة FM تماما.
  10. حافظ على تحضير اليرقات في محلول ملحي طازج خال من Ca2+ للتصوير الفوري باستخدام المجهر متحد البؤر باستخدام بروتوكول التصوير.
  11. لاحظ بعناية NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الوصول إلى نفس NMJ بالضبط بعد تفريغ صبغة FM.
فئة < ص = "jove_title" >4. تحفيز Channelrhodopsin: تفريغ صبغة FM

  1. استبدل محلول ملحي خال من Ca2+ بمحلول ملحي عادي (بدون صبغة FM1-43) في مرحلة مجهر التشريح بمؤشر LED لمنفذ الكاميرا الذي يركز على اليرقة.
  2. اضبط معلمات المحفز للتفريغ (على سبيل المثال ، تردد 15 فولت ، تردد 20 هرتز ، مدة 20 مللي ثانية ووقت دقيقتين (الشكل 2).
  3. ابدأ التحفيز الضوئي وتتبعه بمؤقت للمدة المحددة مسبقا لفترة التحفيز البصري الوراثي (على سبيل المثال ، 2 دقيقة ؛ الشكل 2).
  4. عند انتهاء فترة المؤقت ، قم بإزالة محلول صبغة FM بسرعة واستبدله بمحلول ملحي خال من Ca2 + لإيقاف دورة SV.
  5. يغسل في تتابع سريع بمحلول ملحي خال من Ca2+ (5x لمدة 1 دقيقة) لضمان إزالة الصبغة الخارجية تماما.
  6. حافظ على تحضير اليرقات في محلول ملحي طازج خال من Ca2+ للتصوير الفوري باستخدام المجهر متحد البؤر.
  7. تأكد من تصوير مضان الصبغة FM1-43 في نفس NMJ المذكور أعلاه باستخدام نفس الإعدادات متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: مخطط انسيابي لبروتوكول تحميل الصبغة FM1-43 في ذبابة الفاكهة NMJ. ينتج عن تشريح غراء اليرقات مستحضرا عصبيا عضليا مسطحا ، حيث يقوم الحبل العصبي البطني (VNC) بإسقاط الأعصاب المقطعية من خط الوسط البطني (Vm) إلى مصفوفات عضلات جدار الجسم المتكررة نصف الجزء (الخطوة أ). يتم قطع VNC مجانا ، ثم يتم تحضين تشريح اليرقات بالكامل في محلول FM1-43 الوردي (4 ميكرومتر) استعدادا للتحفيز (الخطوة ب). ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات SylGard 184 سيليكون المطاط الصناعي كيت فيشر ساينتيك NC9644388 لوضع غطاء زجاجي للتشريح غطاء مجهر زجاجي 22x22-1 فيشربراند 12-542-ب لوضع SylGard للتشريح الألومنيوم أعلى لوحة ساخنة نوع 2200 ثيرمولين HPA2235M لعلاج SylGard غرفة تشريح زجاج شبكي غير متاح غير متاح اليدويه الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات WPI 1ب 100 إف -4 لصنع الماصات الدقيقة للشفط والغراء مجتذب الماصات الدقيقة القائم على الليزر أداة سوتر ف-2000 لصنع الماصات الدقيقة للشفط والغراء أنابيب مختبر Tygon E-3603 شركة توريد المكونات تي تي -031 أ لماصة الفم والشفط طرف ماصة P2 الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1111-3700 لماصة الفم 0.6 مل غطاء أنبوب Eppendorf فيشر ساينتيك 05-408-120 تستخدم لوضع الغراء للتشريح فيتبوند 3 م WPI فيتبوند الغراء المستخدم في التشريح كلوريد البوتاسيوم فيشر ساينتيك ف -217 الفورسالين كلوريد الصوديوم ميليبور سيجما S5886 للمحلول الملحي كلوريد المغنيسيوم فيشر ساينتيك م 35-500 للمحلول الملحي ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم ميليبور سيجما [ك7902] للمحلول الملحي سكروز فيشر ساينتيك م5-3 للمحلول الملحي HRP: أليكسا فلور 647 جاكسون للأبحاث المناعية 123-605-021 لتسمية الأغشية العصبية هيبس ميليبور سيجما إتش 3375 للمحلول الملحي الرسام Winsor & Newton 94376864793 للتلاعب باليرقات ملاقط دومون دوموستار # 5 WPI 500233 تستخدم أثناء التشريح مقص ماكفرسون-فاناس 7 سم (شفرات 3 مم) WPI 14177 [14177] [م] تستخدم أثناء التشريح FM1-43 فيشر ساينتيك ت35356 صبغة الفلورسنت ستايريل مؤقت رقمي VWR 62344-641 لتوقيت تحميل / تفريغ صبغة FM LSM 510 META مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر زييس لتصوير علامات الفلورسنت Zen 2009 SP2 الإصدار 6.0 زييس برنامج للتصوير على البؤر المتحد ليزر HeNe 633nm لاسوس لإثارة HRP:647 أثناء التصوير ليزر الأرجون 488 نانومتر لاسوس لإثارة صبغة FM أثناء التصوير مايكرو فورج WPI MF200 لحريق الماصات الدقيقة الزجاجية البولندية مشجعا حشيش S48 للتحكم في LED والتحفيز الكهربائي الشبكية المتحولة بالكامل ميليبور سيجما R2500 العامل المساعد الأساسي ل ChR2 مجهر زايس ستيمي مع منفذ الكاميرا زييس 2000-ج يستخدم أثناء تحفيز القناة رودوبسين LED 470 نانومتر ثورلاب M470L2 تستخدم لتنشيط ChR سائق T-Cube LED ثورلاب الصمام 1 ب للتحكم في LED مزود طاقة LED شركة سينكون للإلكترونيات TR15RA150 لتشغيل مؤشر LED عداد الطاقة الضوئية والطاقة ثورلاب PM100D لقياس شدة LED 40X Achroplan الهدف الغمر في الماء زييس يستخدم أثناء التحفيز الكهربائي والتصوير متحد البؤر

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FM

مقالات ذات صلة