في الجسم الحي تصوير الكالسيوم باستخدام مستشعرات الكالسيوم الموضعية بشكل متشابك في ذبابة الفاكهة السوداء

الملخص

المصدر: Hancock، CE et al.، In Vivo تصوير الكالسيوم البصري للدونة المشبكية الناجمة عن التعلم في ذبابة الفاكهة السوداء.J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي باستخدام مستشعرات الكالسيوم الموضعية بشكل متشابك في الذباب. يحدد خطوات تحضير الذباب للفحص المجهري ، وإجراء التكييف الشمي ، وتصور تدفق الكالسيوم الناجم عن الرائحة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا ، ذبابة الفاكهة السوداء

1. عبر إناث الذباب البكر والذكور (التي ترتفع عند 25 درجة مئوية في رطوبة نسبية 60٪ في دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة) تحمل تركيبات Gal4 و UAS المطلوبة ، على التوالي ، لإنتاج ذباب تعبر فيه الخلايا العصبية المحددة ذات الأهمية عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا.
2. عمر ذرية الإناث من الصليب أعلاه حتى تصبح في حدود 3-6 أيام بعد الإغلاق. يفضل إناث الذباب بسبب حجمها الأكبر قليلا.

فئة

2. تحضير ذبابة الفاكهة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي

1. اختر أنثى ذبابة واحدة وقم بتخديرها على الجليد لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
2. باستخدام ملقط دقيق ، ضع الذبابة في غرفة التصوير (كما هو موضح في الشكل 1 ج). تأكد من ملامسة الصدر والساقين للأسلاك الكهربائية في قاع الغرفة وأن الرأس مسطح. إصلاح موضع الذبابة باستخدام شريط لاصق شفاف.
   ملاحظه: يتطلب هذا البروتوكول غرفة مصممة خصيصا يتم فيها تثبيت الذباب ، مع إمكانية الوصول إلى كبسولة الرأس للفتح ، والذباب قادر على تلقي كل من محفزات الرائحة للهوائيات والصدمات الكهربائية للصدر والساقين (الشكل 1).
3. باستخدام شفرة مشرط جراحية مثبتة على مقبض المشرط (انظر جدول المواد) ، قم بقطع نافذة في الشريط حول رأس الذبابة ، تاركا الهوائيات مغطاة والجزء الأمامي من الصدر مكشوفا فقط.
4. قم بإحاطة جانبي ومؤخرة الرأس بغراء معالج بالضوء الأزرق ، يتم التلاعب به بعناية باستخدام دبوس حشرات مثبت بواسطة فكين مقعرين محدبين. اضبط الغراء باستخدام مصباح LED ينبعث منه الضوء الأزرق.
5. تأكد من ضبط الغراء تماما وقم بإزالة أي غراء غير مقوى متبقي من السطح الظهري لرأس الذبابة.
6. ضع قطرة من محلول Ringer (انظر جدول المواد) لتغطية بشرة الرأس المكشوفة.
7. باستخدام سكين طعنة رفيع النصل ، اقطع بشرة. للحصول على إزالة البشرة الأكثر كفاءة ، قم أولا بقص الجزء الخلفي من الرأس باستخدام الأوسيلي كنقطة انطلاق. بعد ذلك ، قم بقص كل جانب ، وسطي للعينين ، لتشكيل رفرف من البشرة يمكن تمزيقها بسهولة باستخدام الملقط.
8. قم بإزالة أي بشرة زائدة قد تسد منطقة الدماغ التي تهمك.
9. قم بتنظيف السطح الظهري بعناية من أي قصبة هوائية باستخدام ملقط دقيق ، وتجنب تعطيل أنسجة المخ نفسها. قم بإزالة محلول Ringer وتحديثه (انظر جدول المواد) كما هو مطلوب لتنظيف المنطقة من بقايا الأنسجة.
10. ضع إبرة توصيل الرائحة تحت الجلد في وضع على بعد حوالي 1 سم من رأس الذبابة. تأكد من عدم وجود أي شيء يمكن أن يعيق توصيل الرائحة إلى الهوائيات.
11. في المجهر ، قم بتوصيل غرفة التصوير بنظام توصيل الرائحة عبر إبرة توصيل الرائحة تحت الجلد.
12. للسماح للذبابة بالتعافي تماما من التخدير والجراحة ، والتكيف مع تدفق الهواء ، قم بتنفيذ فترة راحة مدتها 10 دقائق في هذه المرحلة.

فئة

3. في الجسم الحي تصوير الكالسيوم

1. استخدم مجهرا متعدد الفوتون مزودا بليزر الأشعة تحت الحمراء وهدف الغمر في الماء (انظر جدول المواد) ، مثبت على طاولة معزولة بالاهتزاز. لتصور مؤشرات الكالسيوم القائمة على البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، قم بضبط الليزر على طول موجي إثارة يبلغ 920 نانومتر وقم بتثبيت مرشح تمرير النطاق GFP.
2. باستخدام مقبض الضبط Z الخشن ، امسح المحور Z للدماغ وحدد موقع منطقة الدماغ التي تهمك. استخدم وظيفة الاقتصاص لتركيز المسح الضوئي على هذه المنطقة فقط لتقليل وقت المسح وتدوير عرض المسح الضوئي بحيث يكون الجزء الأمامي من الرأس متجها لأسفل.
3. اضبط حجم الإطار على 512 × 512 بكسل ، وسرعة المسح الضوئي إلى > 4 هرتز ، ومسح المنطقة (في البعد Y) بحيث يتم تغطية الخلايا العصبية ذات الأهمية.

< p class = "jove_title" >4. تصور عابرات الكالسيوم التي تثيرها الرائحة من خلال التكييف الشمي

1. استخدم نظام توصيل الرائحة الذي يمكنه توصيل العديد من محفزات الرائحة بطريقة دقيقة مؤقتا.
   1. استخدم جهاز كمبيوتر إضافيا للتحكم في الجهاز ، وللتواصل مع برنامج مجهر التصوير لتنسيق تحفيز الرائحة مع التقاط الصور أثناء التجارب.
   2. بدء حزمة ماكرو مبرمجة مسبقا قادرة على ربط برنامج الحصول على الصور وبرنامج توصيل الرائحة (على سبيل المثال ، حزمة ماكرو VBA مثبتة في برنامج التحكم في المجهر ، انظر جدول المواد) التي تستجيب لمشغل إدخال خارجي يتم توفيره عن طريق بدء بروتوكول توصيل الرائحة في برنامج منفصل).
2. ابدأ القياس بمراقبة عابرات الكالسيوم "قبل التدريب" / الساذجة التي تثيرها الرائحة بدقة 512 × 512 بكسل ومعدل إطارات يبلغ 4 هرتز. قم بتوصيل محفز رائحة 2.5 ثانية محاط بالحصول على صورة إضافية لمدة 6.25 ثانية قبل بداية الرائحة (لإنشاء قيمة خط الأساس F₀) و 12.5 ثانية بعد إزاحة الرائحة. كرر هذا مع رائحة ثانية ثم برائحة ثالثة.
3. استمر بعد 3 دقائق من هذا القياس مع التكييف الكلاسيكي ("التدريب") للذبابة.
   1. حدد إحدى الروائح المعروضة في مرحلة "ما قبل التدريب" لتصبح رائحة المنبه المشروط (CS ⁺) وأخرى لتصبح رائحة CS. قدم رائحة CS ⁺ باستخدام نظام توصيل الرائحة الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر لمدة 60 ثانية جنبا إلى جنب مع اثني عشر صدمة كهربائية بجهد 90 فولت.
   2. بعد استراحة 60 ثانية ، قدم رائحة CS وحدها لمدة 60 ثانية. استخدم كروائح 4-ميثيل سيكلوهكسانول و 3-أوكتانول. لا تقدم الرائحة الثالثة (على سبيل المثال ، 1-octen-3-ol) أثناء هذا التدريب حيث يتم استخدامه كعنصر تحكم فقط قبل (الخطوة 4.2) وبعد (الخطوة 4.4) مرحلة التدريب.
4. قم بقياس عابرات الكالسيوم "بعد التدريب" التي تثيرها الرائحة مرة أخرى عن طريق تكرار بروتوكول تحفيز الرائحة "قبل التدريب" (الخطوة 4.2.) بعد 3 دقائق من الانتهاء من مرحلة التدريب (الخطوة 4.3).
   ملاحظه: يجب أن يعكس توقيت هذه الخطوة وقت الاهتمام بعد تكوين الذاكرة (على سبيل المثال ، قم بتنفيذ هذه الخطوة بعد 3-4 دقائق من خطوة التكييف للتحقيق في الذاكرة قصيرة المدى). عادة ، يمكن للذباب البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات في هذا التحضير.
5. احفظ ملفات التصوير بتنسيق مناسب (على سبيل المثال، Tiff) لتحليل الصور لاحقا.

< p class = "jove_title" >5. تحليل الصور

1. لتحليل الصور ، افتح ملفات Tiff (أو ملفات مماثلة) في برنامج تحليل الصور مثل Fiji.
2. قم بمحاذاة المكدسات باستخدام خوارزمية تصحيح الحركة لضمان الحد الأدنى من الحركة في اتجاهين X و Y. تجاهل أي تسجيلات تظهر حركة قوية في المحور Z.
3. حدد أداة البرنامج المستخدمة لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) حول المنطقة المراد فحصها. يجب أن يكون هذا دقيقا قدر الإمكان للحد من تأثير مضان الخلفية.
4. استخدم أداة البرنامج المعنية لاستخراج بيانات شدة التألق الزمني كملفات بيانات من عائد الاستثمار المحدد ، بحيث يتم إنشاء قيمة لكل إطار من إطارات التسجيل.
5. افتح البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات لحساب قيم ΔF / F₀ لكل أثر رائحة. F₀ = متوسط التألق في 2 ثانية قبل ظهور الرائحة. ΔF = الفرق بين التألق الخام في إطار معين و F₀. من هذه القيم ، احسب قيمة ΔF / F₀ لكل إطار ، والتي يمكن رسمها مقابل الوقت لتعكس التألق النسبي طوال فترة تحفيز الرائحة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: بناء غرفة التركيب وإعداد ذبابة للتصوير.(أ) خطوات بناء غرفة تركيب الذبابة. تتكون القاعدة من شريحة مجهر قياسية (1) مغطاة بشبكة بلاستيكية دقيقة (2). يتم لصق سلكين كهربائيين يحملان شحنات متعارضة (3) على الشريحة على كلا الجانبين. يتم تجريد الأسلاك وثنيها لعبور الشريحة (4) التي تعمل بالتوازي مع بعضها البعض ولكن ليس على اتصال. تضاف طبقات من الشريط اللاصق الشفاف (5) حتى ت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1-أوكتين-3-أ.ل سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية [أ5284] مادة كيميائية تستخدم كرائحة 3-أوكتانول سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 218405 مادة كيميائية تستخدم كرائحة 4-ميثيل سيكلوهكسانول سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 153095 مادة كيميائية تستخدم كرائحة مرشح ممر النطاق الترددي ل EGFP (525/50 نانومتر) Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا شريط لاصق واضح إس إي ، نوردرستيدت ، ألمانيا شريط لاصق شفاف قياسي الفكين المقعرين المحدبين أدوات العلوم الجميلة ، شمال فانكوفر ، كندا 10053-09 حاملات شفرات مع فكوك مقعرة محدبة ملقط ناعم أدوات العلوم الجميلة ، شمال فانكوفر ، كندا 11412-11 ملقط بطرف 0.1 × 0.06 مم إبرة تحت الجلد Sterican - B. Braun ، Melsungenk ، ألمانيا 4665120 1.20 × 40 ملم دبابيس الحشرات Minutien أدوات العلوم الجميلة ، شمال فانكوفر ، كندا 26002-10 القطر 0.1 مم ، الطرف 0.0125 مم كينتوفلو كينت إكسبريس للوازم طب الأسنان ، جيلينجهام ، المملكة المتحدة 953683 الغراء المعالج بالضوء الأزرق شريحة مجهر Carl Roth GmbH & Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا 656.1 دولار شريحة الهدف القياسية 76 × 26 مم الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية م 8410 يستخدم كمخفف للروائح ليزر Ti-Sapphire Chameleon Vision 2 المقفل شركة Coherent Inc. ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ليزر فيمتو ثانية بالأشعة تحت الحمراء قابل للضبط مجهر متعدد الفوتون LSM 7MP مزود بكاشفات BiG Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا المجهر متعدد الفوتون ، توفر العديد من الشركات أجهزة مماثلة. هدف الغمر المائي Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا هاتف: 421452-9900-000 الهدف W "Plan-Apochromat" 20x / 1.0 DIC M27 70mm حل Ringer ن. ن. 5 ملي كلوريد كلوريد ، 130 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي ملي كلوريد الصوديوم 2 ، 2 ملي كلوريد الصوديوم 2 ، 5 ملي هيبيس هيدروكسيد الصوديوم ، 36 ملي سكروز ، درجة الحموضة = 7.4 سكين طعنة شاربوينت ، مؤسسة التخصصات الجراحية ، ريدينغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 72-1551 عمق الشفرة المقيد المستقيم 5.0 مم شفرة المشرط الجراحية سوان مورتون ، شيفيلد ، المملكة المتحدة 303 رقم المنتج 11 مقبض مشرط جراحي سوان مورتون ، شيفيلد ، المملكة المتحدة 907 رقم المنتج 7S / S برنامج Visual Basics of Applicatons (VBA) لتلقي مشغل من جهاز توصيل الرائحة وجهاز تطبيق الصدمات الكهربائية (مصدر الطاقة) للتفاعل مع برنامج ZEN من Zeiss الذي يتحكم في المجهر. مكتوبة حسب الطلب ومتاحة عند الطلب ن. ن.