في الجسم الحي تصوير الكالسيوم باستخدام مستشعرات الكالسيوم الموضعية بشكل متشابك في ذبابة الفاكهة السوداء

الملخص

المصدر: Hancock، CE et al.، In Vivo تصوير الكالسيوم البصري للدونة المشبكية الناجمة عن التعلم في ذبابة الفاكهة السوداء.J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي باستخدام مستشعرات الكالسيوم الموضعية بشكل متشابك في الذباب. يحدد خطوات تحضير الذباب للفحص المجهري ، وإجراء التكييف الشمي ، وتصور تدفق الكالسيوم الناجم عن الرائحة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا ، ذبابة الفاكهة السوداء

1. عبر إناث الذباب البكر والذكور (التي ترتفع عند 25 درجة مئوية في رطوبة نسبية 60٪ في دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة) تحمل تركيبات Gal4 و UAS المطلوبة ، على التوالي ، لإنتاج ذباب تعبر فيه الخلايا العصبية المحددة ذات الأهمية عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا.
2. عمر ذرية الإناث من الصليب أعلاه حتى تصبح في حدود 3-6 أيام بعد الإغلاق. يفضل إناث الذباب بسبب حجمها الأكبر قليلا.

فئة

2. تحضير ذبابة الفاكهة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي

1. اختر أنثى ذبابة واحدة وقم بتخديرها على الجليد لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
2. باست....

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: بناء غرفة التركيب وإعداد ذبابة للتصوير.(أ) خطوات بناء غرفة تركيب الذبابة. تتكون القاعدة من شريحة مجهر قياسية (1) مغطاة بشبكة بلاستيكية دقيقة (2). يتم لصق سلكين كهربائيين يحملان شحنات متعارضة (3) على الشريحة على كلا الجانبين. يتم تجريد الأسلاك وثنيها لعبور الشريحة (4) التي تعمل بالتوازي مع بعضها البعض ولكن ليس على اتصال. تضاف طبقات من الشريط اللاصق الشفاف (5) حتى ت.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1-أوكتين-3-أ.ل سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية [أ5284] مادة كيميائية تستخدم كرائحة 3-أوكتانول سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 218405 مادة كيميائية تستخدم كرائحة 4-ميثيل سيكلوهكسانول سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 153095 مادة كيميائية تستخدم كرائحة مرشح ممر النطاق الترددي ل EGFP (525/50 نانومتر) Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا شريط لاصق واضح إس إي ، نوردرستيدت ، ألمانيا شريط لاصق شفاف قياسي الفكين المقعرين المحدبين أدوات العلوم الجميلة ، شمال فانكوفر ، كندا 10053-09 حاملات شفرات مع فكوك مقعرة محدبة ملقط ناعم أدوات العلوم الجميلة ، شمال فانكوفر ، كندا 11412-11 ملقط بطرف 0.1 × 0.06 مم إبرة تحت الجلد Sterican - B. Braun ، Melsungenk ، ألمانيا 4665120 1.20 × 40 ملم دبابيس الحشرات Minutien أدوات العلوم الجميلة ، شمال فانكوفر ، كندا 26002-10 القطر 0.1 مم ، الطرف 0.0125 مم كينتوفلو كينت إكسبريس للوازم طب الأسنان ، جيلينجهام ، المملكة المتحدة 953683 الغراء المعالج بالضوء الأزرق شريحة مجهر Carl Roth GmbH & Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا 656.1 دولار شريحة الهدف القياسية 76 × 26 مم الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية م 8410 يستخدم كمخفف للروائح ليزر Ti-Sapphire Chameleon Vision 2 المقفل شركة Coherent Inc. ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ليزر فيمتو ثانية بالأشعة تحت الحمراء قابل للضبط مجهر متعدد الفوتون LSM 7MP مزود بكاشفات BiG Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا المجهر متعدد الفوتون ، توفر العديد من الشركات أجهزة مماثلة. هدف الغمر المائي Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا هاتف: 421452-9900-000 الهدف W "Plan-Apochromat" 20x / 1.0 DIC M27 70mm حل Ringer ن. ن. 5 ملي كلوريد كلوريد ، 130 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي ملي كلوريد الصوديوم 2 ، 2 ملي كلوريد الصوديوم 2 ، 5 ملي هيبيس هيدروكسيد الصوديوم ، 36 ملي سكروز ، درجة الحموضة = 7.4 سكين طعنة شاربوينت ، مؤسسة التخصصات الجراحية ، ريدينغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 72-1551 عمق الشفرة المقيد المستقيم 5.0 مم شفرة المشرط الجراحية سوان مورتون ، شيفيلد ، المملكة المتحدة 303 رقم المنتج 11 مقبض مشرط جراحي سوان مورتون ، شيفيلد ، المملكة المتحدة 907 رقم المنتج 7S / S برنامج Visual Basics of Applicatons (VBA) لتلقي مشغل من جهاز توصيل الرائحة وجهاز تطبيق الصدمات الكهربائية (مصدر الطاقة) للتفاعل مع برنامج ZEN من Zeiss الذي يتحكم في المجهر. مكتوبة حسب الطلب ومتاحة عند الطلب ن. ن.