تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية البصرية الوراثية للخلايا ذات القنوات الأيونية المعتمدة على الضوء

الملخص

المصدر: Grimm, C., et al. تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة لتحديد الفيزيولوجيا الكهربية لانتقائية الأيونات في قنالاترودوبسين. J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، توضح مزارع خلايا الكلى الجنينية التي تعبر عن بروتينات القناة الأيونية المعتمدة على الضوء المدمجة مع مراسل الفلورسنت تأثير الضوء على حركة الأيونات. يستخدم مشبك التصحيح للخلية الكاملة لمراقبة حركة الأيونات.

البروتوكول

1. الإعداد قبل التسجيلات

1. قم بإعداد محاليل التسجيل بتركيزات الأيونات كما هو موضح في الجدول 1.​
   1. قم بإعداد 15 مل من محاليل مخزون 2 M في ماء فائق النقاء ل MgCl₂ و CaCl₂ و KCl و CsCl.
   2. قم بوزن المكونات الصلبة ل 100 مل من المحاليل داخل الخلايا و 500 مل من المحاليل المخزنة خارج الخلية وفقا للجدول 1 في أكواب منفصلة وأضف الكمية الخاصة من محاليل المخزون المحضرة بعد ذلك. على سبيل المثال ، بالنسبة للمخزن المؤقت داخل الخلايا ، استخدم 0.3803 جم (10 ملم) EGTA (حمض رباعي أسيتيك الإيثيلين جلايكول) ، 0.2383 جم (10 ملم) HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك) و 0.6428 جم (110 ملم) كلوريد الصوديوم وأضف 100 ميكرولتر من 2 M MgClCl₂ و CaCl₂ و 50 ميكرولتر من محاليل مخزون 2 M KCl و CsCl.
   3. أضف الماء عالي النقاء واضبط درجة الحموضة بعناية باستخدام الأحماض والقواعد ، والتي لا تتداخل مع القياس ، أي لا يتم إجراؤها بواسطة ChR (Channelrhodopsins) ، مثل حامض الستريك و N-methyl-D-glucamine (NMG +).
   4. اضبط الأسمولية على 290 مللي أسمول للخلايا وإلى 320 مللي أسم للمحاليل خارج الخلية مع الجلوكوز.
      ملاحظه: تزيد المحاليل داخل الخلايا ناقصة التناضح قليلا من معدل نجاح الترقيع.
   5. قم بتصفية جميع المحاليل المعقمة من خلال مرشحات 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين المحاليل في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين أو قم بتجميدها عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
2. احسب إمكانات الوصلة السائلة وقم بإعداد بروتوكولات التسجيل.
   ملاحظة: يؤدي تغيير تركيز الكلوريد خارج الخلية بعد إنشاء تكوين الخلية بأكملها إلى إمكانية توصيل سائل كبيرة (LJP) يجب تصحيحها. يمكن قياس LJPs أو حسابها مباشرة ، هنا ، يتم استخدام الخيار الأخير. في هذا البروتوكول ، سيتم استخدام التصحيح عبر الإنترنت ، مما يتطلب بروتوكول تسجيل واحد لكل مخزن مؤقت خارجي. ومع ذلك ، بالنسبة لمجموعة أكبر من الحلول الخارجية ، يوصى بتصحيح ما بعد LJP لتجنب التصحيح الخاطئ.
   1. افتح حاسبة إمكانات التقاطع (JPC) وافتح مربع حوار "تجربة جديدة". ثم حدد "قياسات مشبك التصحيح". حدد "قياسات الخلية الكاملة" و "قطب محلول الملح القياسي" وأدخل درجة حرارة 25 درجة مئوية. بين كل خطوة ، امض قدما بقبول التحديد بالضغط على الزر "التالي".
      ملاحظة: تجرى التجارب في درجة حرارة الغرفة 25 درجة مئوية في مختبر مكيف. تأكد من أن المحاليل العازلة لها درجة حرارة الغرفة قبل بدء التجارب. لتغيير درجة حرارة العينة ، يمكن استخدام مرحلة حضانة أو غرفة. يمكن قياس درجة حرارة الحمام بشكل متكرر باستخدام مقياس حرارة.
   2. أضف جميع تركيزات الأنيون والكاتيون الفردية للمحلول الماصة ومخزن الكلوريد العالي وفقا للتركيزات المدرجة في الجدول 1.
      ملاحظه: سيحسب JPC LJP قدره -0.5 مللي فولت لظروف البدء.
   3. انقر فوق "محلول حمام جديد" لإدخال التركيب الأنيوني والكاتيوني للمخزن المؤقت منخفض الكلوريد.
      ملاحظه: سيقوم JPC الآن بحساب LJP جديد يبلغ +12.6 مللي فولت وفقا لحل التسجيل خارج الخلية المتغير.
   4. قم بإعداد بروتوكولين مصححين بواسطة LJP لشرطي القياس عن طريق طرح LJP المحسوب من إمكانات الاحتفاظ المطبقة ؛ -0.5 مللي فولت للارتفاع و +12.6 مللي فولت للمحاليل الخارجية منخفضة الكلوريد. وبالتالي تبدأ البروتوكولات ب -79.5 مللي فولت (كلوريد عالي) و -92.6 مللي فولت (كلوريد منخفض) ، على التوالي للحصول على إمكانية الاحتفاظ ببدء مصححة بواسطة LJP تبلغ -80 مللي فولت في كلتا الحالتين.
      ملاحظه: تنطبق الخطوات التالية على برنامج الحصول على البيانات المذكور في قائمة المواد.
   5. افتح محرر البروتوكول في برنامج الاكتساب. من قائمة "الوضع" ، حدد "التحفيز العرضي" وقم بتضمين 7 عمليات مسح.
   6. قم بالتبديل إلى قائمة "شكل الموجة" في المحرر وقم بتضمين فترة 200 مللي ثانية مع إمكانية الاحتفاظ ب 0 مللي فولت متبوعة بفترة 2 ثانية مع إمكانات احتجاز متفاوتة تبدأ من -79.5 مللي فولت للكلوريد العالي. قم بتضمين "مستوى دلتا" 20 مللي فولت للفترة الثانية لزيادة إمكانية الاحتفاظ بمقدار 20 مللي فولت في كل عملية مسح.
   7. ضمن خطوات الجهد لمحرر الشكل الموجي ، قم بتطبيق فترة إضاءة تبلغ 500 مللي ثانية مع ضوء 540 نانومتر (3.10 ميجاوات / مم²). للقيام بذلك، قم بتغيير "نمط البت الرقمي" للغالق المتصل الذي يتحكم في مصدر الضوء ليكون نشطا لمدة 500 مللي ثانية بعد الفترة الثانية الموضحة أعلاه (انظر 1.2.6).
      ملاحظه: يمكن أن تؤثر شدة الضوء على الخصائص الفيزيائية الحيوية لتيارات القناة مثل السعة أو التعطيل. لذلك ، يجب دائما الإبلاغ عن كثافات الطاقة الخفيفة. لقياس قوة الضوء بعد المرور عبر جميع البصريات والغطاء ، استخدم مقياس بصريات معاير. لحساب كثافة الطاقة ، حدد المجال المضيء للهدف بواسطة ميكرومتر كائن واقسم طاقة الضوء المقاسة على المجال المضيء المحدد.
   8. احفظ البروتوكول للمحلول خارج الخلية عالي الكلوريد. قم بتعديل البروتوكول واستبدل إمكانات الاحتفاظ بالمستوى الأول ب -92.6 مللي فولت (كلوريد خارجي منخفض). احفظ هذا البروتوكول الثاني لقياس حالة الكلوريد المنخفض خارج الخلية.
3. طلاء اللايسين للأغطية الزجاجية وفقا للبروتوكول المعدل.​
   1. ضع عدة 100 غطاء في طبق بتري زجاجي وأضف 250 مل من حمض الهيدروكلوريك (1 نيوتن).
   2. ضع طبق بتري مع زلات الغطاء على شاكر خطي. رج العبوة عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة لتنظيف الغطاء ، وبعد ذلك ، اشطفها بالماء فائق النقاء لتحييد درجة الحموضة.
   3. انقعها في حجم صغير من 95٪ من الإيثانول لمزيد من التنظيف.
      ملاحظة: يمكن تخزين زلات الغطاء النظيفة في 70٪ من الإيثانول قبل المتابعة. اعمل تحت غطاء التدفق الصفحي للخطوات التالية.
   4. باستخدام موقد بنسن والملاقط ، قم بإشعال كل غطاء وانقله إلى طبق بتري جديد.
   5. احتضان الغطاء الزجاجي بمحلول بولي دي ليسين معقم 50 ميكروغرام / مل لمدة ساعة واحدة على الأقل (أو بين عشية وضحاها) في درجة حرارة الغرفة أثناء الاهتزاز باستخدام شاكر خطي عند 150 دورة في الدقيقة.
   6. اغسل الغطاء بالماء فائق النقاء لإزالة الفائض من بولي دي ليسين.
   7. انشر زلات الغطاء على ورق معقم حتى يجف لمدة 10 دقائق ، وقم بتعريضها للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) للتعقيم (20 دقيقة على الأقل).
   8. اجمع الأغطية في طبق بتري معقم مغطى بورق الألمنيوم حتى الاستخدام.
4. تحضير الحمض النووي لجين PsACR1 المدمجة في mCherry باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.​
   1. استنساخ التسلسل الجيني المحسن للكودون البشري الذي يشفر PsACR1 في بلازميد peGFP-C1 (CMV (الفيروس المضخم للخلايا) المحفز ، مقاومة الكاناميسين) في الإطار باستخدام mCherry fluorophore باستخدام إنزيمات التقييد أو طرق الاستنساخ الأخرى المعمول بها.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الفلوروفورات الأخرى ، ولكن تأكد من توفر مجموعات المرشحات المقابلة لمراقبة تألقها تحت المجهر في الإعداد.
   2. قم بتحويل الحمض النووي البلازميد إلى خلايا الإشريكية القولونية XL1Blue ذات الكفاءة الكيميائية عبر الصدمة الحرارية وفقا للبروتوكول القياسي ووضعها على ألواح أجار (30 ميكروغرام / مل كاناميسين). تنمو البكتيريا المطلية طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
   3. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 4 مل من وسط مرق Lysogeny المكمل ب 30 ميكروغرام / مل من الكاناميسين بخلايا من مستعمرات مفردة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة في حاضنة.
   4. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بتنقية الحمض النووي البلازميد من الثقافات باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
5. بذر الخلايا
   ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات تحت غطاء التدفق الرقائقي.
   1. ضع ما يصل إلى ثلاثة أغطية زجاجية مطلية بالليسين جنبا إلى جنب في طبق بتري مقاس 35 مم.
      ملاحظه: اضغط عليها برفق على قاع الطبق لمنع الانزلاق على بعضها البعض.
   2. بذور 1.5 × 10⁵ HEK (خلايا الكلى الجنينية البشرية) في 2 مل معيار Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنين (FBS) في كل طبق.
   3. استكمل الشبكية المتحولة بالكامل بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. قم بتنمية الخلايا لمدة يوم واحد على الأقل قبل متابعة الخطوة 1.6.
نقل
6. الخلايا بشكل عابر عن طريق الدهون الدهونية.
   1. لكل طبق من الخلايا ، قم بإعداد محلول مكون من 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (حمض الديوكسي ريبونوكلييك) في 250 ميكرولتر DMEM بدون FBS و 6 ميكرولتر كاشف تعداد.
   2. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، أضف المحلول برفق (بالتنقيط) إلى الخلايا.
7. تحضير جسور أجار
   1. أضف 0.75 جم من الاغاروز إلى 50 مل من محلول كلوريد الصوديوم المعقم (140 ملم) وقم بإذابته عن طريق التسخين في الميكروويف.
      ملاحظة: 2-3 M KCl لإعداد جسر أجار يقلل من LJP بسبب التركيز العالي (مثل الانتشار المستمر من الجسر) والحركة المتساوية لأيونات K + و Cl- ، ولكن تم تجنبها لتقليل تسرب الأيونات (خاصة Cl-) إلى محلول الحمام.
   2. املأ أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر (أو خرطوم بقطر صغير) بمحلول الاغاروز السائل باستخدام حقنة.
      ملاحظه: تجنب فقاعات الهواء في الجسر.
   3. بعد تبريد جسور الأجار وترسيخها ، قم بتخزينها في محلول كلوريد الصوديوم المعقم 140 ملليمتر.
8. تحضير أقطاب التسجيل والاستحمام.​
   1. قم بإزالة الأسلاك الفضية من الحمام وتسجيل قطب الإعداد المشبك التصحيح.
   2. قم بتلميع الأسلاك بورق الصنفرة لإزالة كلوريد الفضة من التجارب السابقة. اغمر السلك الفضي النظيف في 3 M KCl وقم بتوصيله بالقطب الموجب لبطارية 1.5 فولت للطلاء الكهربائي بكلوريد الفضة.
      ملاحظة: يمكن استخدام مصدر طاقة المختبر بدلا من البطارية.
9. اسحب ماصات الرقعة منخفضة المقاومة (1.5-3.0 MΩ) من الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة دقيقة وقم بتلميعها بالنار. قم بتخزين الماصات خالية من الغبار ليوم القياس.
10. قم بتشغيل جميع مكونات الإعداد للتسخين حتى درجة حرارة العمل قبل 30 دقيقة من التسجيلات. تأكد من أن المخازن المؤقتة في درجة حرارة الغرفة.

2. قياسات الانتقائية

1. ابدأ التسجيلات من 24 إلى 48 ساعة بعد تعداء عابر للخلايا.
2. ضع غطاء واحد في حجرة القياس وأغلقه بالسيليكون لمنع تسرب المخزن المؤقت الخارجي. قم بتخزين طبق بتري مع الأغطية الأخرى في حاضنة للمجموعة التالية من التجارب.
3. املأ الغرفة بعناية بمخزن مؤقت خارج الخلية (مرتفع [Cl-]) لمنع انفصال الخلية ، ثم ضعه تحت المجهر واستخدم هدف 40X لتصور الخلايا.
4. ضع جسر أجار فوق قطب الحمام وضعه في الغرفة مع مستشعر مستوى السائل ومخرج التروية لمعالج الحمام.
5. استبدل المحلول خارج الخلية مرتين ب 1 مل من المحلول الخارجي الطازج (مرتفع [Cl-]) لإزالة الخلايا المتوسطة المتبقية والخلايا المنفصلة.
6. اجعل الخلايا في بؤرة التركيز وابحث عن خلية منقولة (فلورسنت) ، والتي تحتاج إلى عزلها عن الخلايا الأخرى. استخدم مجموعة مرشحات ثلاثية النطاق وضوء برتقالي (590 نانومتر ؛ عرض النطاق الترددي 15 نانومتر ؛ كثافة 100٪) لإثارة وتصور mCherry.
   ملاحظه: يمكن أن تقترن خلايا HEK كهربائيا بجيرانها عن طريق تقاطعات الفجوة مما يؤدي إلى انخفاض مقاومة الغشاء في تكوين الخلية بأكملها.
7. املأ إحدى الماصات المسحوبة بمحلول داخل الخلايا وقم بإزالة فقاعات الهواء عن طريق قلب الماصة عدة مرات.
8. قم بتركيب الماصة على حامل الماصة وقم بالضغط الإيجابي لمنع انسداد الطرف.
9. حدد موقع طرف الماصة اللاصقة أسفل المجهر وانتقل بالقرب من الخلية باستخدام المعالج الدقيق.
   ملاحظه: تنطبق الخطوات التالية على مكبر الصوت والحصول على البيانات وبرنامج التقييم المذكور في قائمة المواد.
10. ابدأ "اختبار الغشاء" في برنامج الحصول على البيانات وقم بتطبيق خطوة الجهد (نبضة الاختبار ؛ على سبيل المثال 5 مللي فولت لمدة 10 مللي ثانية ، خط الأساس عند 0 مللي فولت) ، يدويا أو تلقائيا عبر برنامج محدد باستخدام "وضع الاستحمام" أثناء تشغيل "اختبار الغشاء" في برنامج الحصول على البيانات.
11. تأكد من أن مقاومة الماصة في النطاق المطلوب (1.5-3.0 MΩ).
12. تيارات إزاحة صفرية عن طريق ضبط إمكانات الماصة عن طريق تدوير مقبض إزاحة الماصة في مكبر الصوت أثناء العمل في "وضع الاستحمام" الخاص ب "اختبار الغشاء".
13. قم بإنشاء تصحيح في تكوين الخلية بأكملها.
    ملاحظة: تتطلب الخطوات التالية تطبيق الضغط الإيجابي والسالب الذي يتم توصيله إلى المنفذ الجانبي لحامل الماصة المستخدم. يمكن القيام بذلك إما باستخدام حقنة أو عن طريق قطعة فم أو منظم ضغط يتم التحكم فيه إلكترونيا. في هذا البروتوكول ، يتم تطبيق الضغط الإيجابي والسلبي عبر قطعة الفم.
    1. اقترب ببطء من الخلية باستخدام ماصة التصحيح من الأعلى وخفف الضغط الإيجابي قبل لمسها مباشرة.
       ملاحظة: عندما يكون الطرف قريبا من الخلية ، سترتفع المقاومة قليلا ؛ يشار إلى ذلك من خلال انخفاض حجم نبضة الاختبار.
    2. قم بتغيير "اختبار الغشاء" من "وضع الحمام" إلى "وضع التصحيح" وبالتالي إمكانية الاحتفاظ بإمكانية الراحة المتوقعة للخلايا (-30 إلى -40 مللي فولت).
    3. في بعض الحالات يشكل التكوين [سل-لينتيك] بعد إطلاق من الضغطة إيجابية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بالضغط السلبي برفق للمساعدة في تكوين gigaseal.
       ملاحظه: يتم إنشاء التكوين المتصل بالخلية عندما يتم تقليل نبضة الاختبار إلى قمتين سعويتين صغيرتين في بداية النبضة ونهايتها، وتكون مقاومة الغشاء في نطاق GΩ؛ قد تسهل الفولتية السالبة التي تصل إلى -60 مللي فولت تكوين الجيجاسيل.
    4. قم بتعويض سعة الماصة عن طريق تدوير مقابض "تعويض سعة الماصة" للحصول على استجابة مسطحة لنبضة الاختبار.
    5. تمزق الرقعة دون تدمير الختم عن طريق تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي أو الضغط السلبي مع زيادة القوة ، للحصول على تشكل الخلية الكاملة.
       ملاحظه: يشار إلى الانتقال الناجح من تكوين الخلية المرفقة إلى تكوين الخلية بأكملها من خلال زيادة القمم السعوية.
    6. قم بتطبيق تعويض المقاومة المتسلسلة عن طريق تعيين معلمة الخلية الكاملة وتعديلات التعويض لمكبر الصوت المستخدم لتثبيت دقيق لإمكانات الغشاء على جهد التثبيت المطلوب.
       1. قم بتبديل "اختبار الغشاء" إلى وضع "الخلية الكاملة" ، في لوحة "تعويض المقاومة المتسلسلة" ، قم بتشغيل "التنبؤ" و "التصحيح" بنسبة تصل إلى 90٪ ، وتجنب التجاوزات وتذبذب الاستجابة السعوية ، وقم بتشغيل مفتاح تعويض الخلية بأكملها وضبط معلمات الخلية بأكملها باستخدام مقابض اللوحة الأمامية المناسبة ("سعة الخلية الكاملة" و "مقاومة المتسلسلة") لمكبر الصوت بطريقة تكرارية للحصول على بشكل مثالي استجابة ختم الاختبار المسطحة.
          ملاحظه: للحصول على وصف تفصيلي لتعويض مقاومة السلسلة وتصحيحها ، راجع دليل مكبر الصوت أو المبدأ التوجيهي لأن هذا الإجراء يختلف بين المصنوعات المختلفة.
    7. بعد إنشاء تكوين الخلية بأكملها، انتظر دقيقتين على الأقل قبل التسجيل لضمان الاستبدال الكافي للمحلول داخل الخلايا من خلال ماصة التصحيح.
14. سجل التيارات التي يسببها الضوء عند إمكانات احتجاز مختلفة باستخدام البروتوكولات التي تم إعدادها مسبقا (في 1.2).
15. استبدل المخزن المؤقت خارج الخلية إلى منخفض [Cl-] في الغرفة خمس مرات على الأقل دون تدمير الرقعة وسجل علاقة تيار جهد أخرى (راجع الخطوة 1.2) بتركيز الكلوريد الجديد.
    ملاحظه: يسهل نظام التروية للتبادل الآلي للمخزن المؤقت هذه العملية ولكنه ليس ضروريا.
16. كرر 2.15. لكل حالة أيونية يتم اختبارها ، ولكن تحقق مرارا وتكرارا من جودة الرقعة بين القياسات عن طريق "اختبار الغشاء" الموضح أعلاه.
    ملاحظه: لضمان جهد الغشاء الدقيق وتكوين الأيونات المستقرة داخل الخلايا ، يجب أن تكون مقاومة الغشاء أعلى من 500 MΩ بينما يجب ألا تتجاوز مقاومة الوصول 10 MΩ ، انظر 2.12.6). لا تنس إيقاف تشغيل تعويض معلمة الخلية بأكملها لاختبار الغشاء.
17. كرر 2.2. إلى 2.15. لعدة خلايا ، ولكن خذ قسيمة غطاء جديدة لكل سلسلة اختبار لضمان صحة الخلايا.

الجدول 1: التركيب الأيوني للمحاليل المخزنة. تكوين المخازن المؤقتة داخل الخلايا (داخل) وخارج الخلية (الإضافية) لتجارب انتقائية الكلوريد في خلايا HEK. الاختصارات المستخدمة: حمض رباعي الأسيتيك جلايكول الإيثيلين (EGTA) ، 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) والأسبارتات (ASP). جميع التركيزات بالمللي مولار.

داخل. إضافي.1 اضافي.2 كلوريد عالي كلوريد منخفض كلوريد منخفض ج [م] ج [م] ج [م] Na-ASP 0 0 140 حيا كلوريد الصوديوم 110 140 حيا 0 كيه سي إل 1 1 1 سي إس إل 1 1 1 كلوريد_{الهواء 2} 2 2 2 مغنكلوريد₂ 2 2 2 هيبس 10 10 10 EGTA 10 0 0 الرقم الهيدروجيني 7.2 7.2 7.2 الأسمولية 290 ملي أسم 320 مللي أوسالم 320 مللي أوسالم

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا HEK293 سيجما ألدريتش 85120602 خلايا الكلى الجنينية البشرية الشبكيه سيجما ألدريتش R2500 شبكية العين المتحولة بالكامل فوجين HD بروميجا E2312 كاشف التعداء DMEM بيوكروم FG 0445 وسط النسر المعدل من Dulbecco أغاروز روث 3810 دولار جسور أجار CaCl2 روث 5239 CaCl2 2H2O سي إس إل بيورومول 2452 ريال EGTA روث 3054 FBS بيوكروم S0615 زراعة الخلايا الجلوكوز روث HN06 د (+) - الجلوكوز كيه سي إل روث 6781 [م] كلوريد المغنيسيوم 2 روث 2189 MgCl2 6H2O كلوريد الصوديوم روث 3957 إن إم جي سيجما ألدريتش M2004 ن-ميثيل-د-جلوكامين سبارتات سيجما ألدريتش أ6683 حمض الأسبارتيك ملح الصوديوم أحادي الهيدرات حامض الستريك روث 6490 ريال العمري ثيرموفيشر ساینتفيكي ER1462 إنزيم التقييد XhoI ثيرموفيشر ساینتفيكي ER0695 إنزيم التقييد نهي ثيرموفيشر ساینتفيكي ER0975 إنزيم التقييد XL1 الإشريكية القولونية الزرقاء / تقنيات Agilent 200249 الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا كاناميسين روث تي 832 مرق Lysogeny وسط روث إكس 964 أجار أجار روث 6494 لوحات أجار طقم تنقية البلازميد مارشيري ناجل 740727.25 البنيسيلين / الستربتومايسين بيوكروم أ 2213 زراعة الخلايا بولي د-ليسين هيدروبروميد سيجما ألدريتش P6407-5 ملغ طلاء انزلاق الغطاء ميكروفورج حسب الطلب تلميع النار الماصات المصلية برنامج النقاط التجارية أحجام مختلفة مقعد نظيف كجير بيوجازرد SL130 النمام إيكا RCT الكلاسيكية سلك فضي منتجات علمية AG-T25; AG-T10 الأقطاب الكهربائية، 0.64 مم (الحمام)؛ 0.25 مم (قطب كهربائي) مقياس الأس الهيدروجيني 765 كاليمتريك مقياس التناضح فوغل 815 أم مجهر كارل زايس رقم الهوية03 تلميع النار حاضنة CO2 الموثق سي بي 150 أطباق زراعة الخلايا برنامج النقاط التجارية 93040 القطر الداخلي 34 مم زلات الغطاء روث ص 232 قطر 15 مم ترمومتر روسيل ميستشنيك MTM12 شعاع التقسيم صفاء 21011 ناقل الحركة 90/10 حامل الماصة أدوات علاء العلمية PPH-1P-AXU-0-1.5 هيدستيج الأجهزة الجزيئية CV203BU مكبر الأجهزة الجزيئية AxoPatch200B محول الأرقام الأجهزة الجزيئية ديجي داتا1400 المحول التناظري الرقمي مصدر الضوء الضوئيات TILL متعدد الألوان V ضبط على 540 نانومتر كثافة كاملة مجهر كارل زايس أكسيفرت 100 مصراع فنسنت أسوشيتس في إس 25 سائق الغالق فنسنت أسوشيتس VCM-D1 كابلاري زجاجي وارنر إنسترومنتس G150F-3 الشعيرات الدموية البورسليكات ذات النهايات المصقولة بالنار OD 1.5 مم معرف 0.86 مم مجتذب الماصات الدقيقة أدوات سوتر ص 1000 معالج الحمام Lorenz Messgerätebau MPCU مجموعة مرشحات ثلاثية النطاق صفاء 69008 مرشح التألق ECFP / EYFP / mCherry كاميرا CCD واتيك وات-221SCCD عداد البصريات جيجاهرتز أوبتيك P9710 قياس شدة الضوء هدف كارل زايس هاتف: 421462-9900-000 مخطط W - Apochromat 40X / 1.0 DIC معالج دقيق علمية باتش ستار غرفة التسجيل حسب الطلب مزود الطاقة مانسون HCS-3202 يتجنب الضوضاء الكهربائية من مصدر الطاقة المدمج في المجهر طاولة معزولة للاهتزاز نيوبورت M-VW-3636-OPT-01 قفص فاراداي حسب الطلب أو أي طاولة مطابقة تجارية الخراطيم أي كوميدي ؛ على سبيل المثال روث أحجام ومواد مختلفة لمناولة الحمام وتطبيق ضغط الماصة ؛ جسور أجار شاكر خطي أدوات صن لاب سو 1000 حاسبة إمكانات تقاطع السائل الأجهزة الجزيئية أو مباشرة من بيتر إتش باري يتم تضمين البرنامج في برنامج اكتساب Clampex أو يمكن الحصول عليه من p.barry@unsw.edu.au برنامج الحصول على البيانات الأجهزة الجزيئية كلامبكس 10.X برنامج تقييم البيانات الأجهزة الجزيئية Clampfit 10.X PsACR1 GenBank أو Addgene KF992074.1 أو بلازميد Addgene # 85465 ترميز الجينات ل PsACR1 دليل مكبر الصوت الأجهزة الجزيئية دليل Axon