$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. التسجيل
ملاحظة: في هذا الإجراء ، عادة ما يتم إجراء تسجيلات مشبك التصحيح من العقدة المعزولة بعد 12-24 ساعة من الطلاء. وقد أفادت مختبرات أخرى نتائج من الخلايا العصبية بعد فترات أطول بكثير في الثقافة.
- تحضير غرفة التسجيل
- استخدم غرفة تسجيل التبادل السريع (أو ما يعادلها) التي تسمح بتسجيلات مشبك التصحيح مباشرة في طبق الثقافة. قم بإعداد الغرفة على المجهر المقلوب.
- أدخل أطباق الثقافة ذات القاع الزجاجي في الغرفة.
- قم بتغذية محلول L-15 من خلال نظام أنابيب التروية إلى غرفة التسجيل. قم بتثبيت التروية في التدفق والتدفق الخارجي في الغرفة بمعدل 0.5-1 مل في الدقيقة.
- تحضير الحل الداخلي لتحميل الأقطاب الكهربائية
- قم بإذابة جزء من المحلول الداخلي المثقوب. خصص 2.5 مل من المحلول على طبق ثقافة 35 مم. استبدل غطاء طبق الثقافة وقم بتسميته على أنه "Tip Dip". توضع جانبا في منطقة خالية من الغبار ، حيث من المهم جدا الحفاظ على هذا المحلول نظيفا قدر الإمكان.
- يزن 1 ملغ من الأمفوتريسين-ب ويضاف 20 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). دوامة وتدوير المحلول حتى يصبح كل الأمفوتريسين-B في المحلول. أضف 10 ميكرولتر من محلول DMSO / الأمفوتريسين-B إلى 2 مل المتبقية من المحلول الداخلي المثقب المذاب. اسحب المحلول وقم بتبديده باستخدام ماصة مرتين أو ثلاث مرات للتأكد من اختلاط DMSO/الأمفوتريسين-B بشكل موحد في المحلول الداخلي. سيكون للمحلول مسحة صفراء خفيفة.
- ارسم المحلول الداخلي المثقب الأمفوتريسين-B في حقنة سعة 3 مل. أضف طرف 34 جم إلى المحقنة. لف المحقنة بورق الألمنيوم واحتفظ بالمحقنة على الثلج.
ملاحظه: يجب إعادة صنع هذا المحلول كل ساعتين لضمان فعالية الأمفوتريسين-ب في تثقيب غشاء الخلية. الأمفوتريسين-ب حساس للضوء ، ويجب حمايته من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم أو طرق أخرى.
- تسجيلات المشبك التصحيح
- تصور الخلايا العصبية باستخدام هدف 10x أو 20x. اضبط الإضاءة وقم بتحسين البصريات لرؤية الحدود والظلال حول الخلية.
- تحقق من جودة الخلايا العصبية المعزولة. حاول فقط الخلايا العصبية ذات الأسطح الملساء والمتساوية التي لا تتناقض بشدة ولها فوهات صغيرة ومشتتة فقط. تأكد أيضا من تجنب أزواج الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية المحاطة بالحطام أو الخلايا الأخرى.
- تحت تكبير 100x ، حدد خلية عصبية أو مجال من الخلايا العصبية لتصحيحها واصطفافها في وسط مجال الرؤية.
- املأ طرف الماصة بمحلول نظيف لا يحتوي على أمفوتريسين عن طريق غمس الطرف (لمدة ~ 20 ثانية) في المحلول النظيف الذي تم وضعه في طبق الاستزراع. سيؤدي العمل الشعري إلى سحب كمية صغيرة من المحلول إلى الحافة.
ملاحظه: قم بتنفيذ هذه الخطوة تحت مجهر تشريح استريو ، مما يسمح بتحديد مدى جودة احتفاظ الطرف بمحلول Tip Dip. إذا لم يصمد المحلول لمدة ~ 10-20 ثانية ، فإن شكل القطب ليس مثاليا. في هذه الحالة ، أعد تكوين برنامج سحب القطب الكهربائي لإنتاج طرف أطول.
- بعد ذلك، املأ الجزء الخلفي من الماصة بالمحلول الداخلي الذي يحتوي على الأمفوتريسين. سيقوم الفتيل الموجود داخل الماصة بسحب المحلول لأسفل لتلبية المحلول النظيف الموجود في الحافة. اسمح للفتيل بسحب المحلول بسلاسة لأسفل ، ولا تحاول النقر على الفقاعات ، لأن هذا سيجبر الأمفوتريسين على الحافة بسرعة كبيرة.
- استخدم حقنة لسحب المحلول الذي قد يكون في الجزء الخلفي من القطب.
ملاحظه: من المهم جدا العمل بسرعة من هذه النقطة إلى الأرض وتشكيل ختم عالي المقاومة على الخلية المطلوبة.
- أدخل الماصة في حامل الماصة. تأكد من أن الماصة محكمة في الحامل لمنع انجراف الماصة. إذا كانت الماصة غير مستقرة، فقم بإيقاف تشغيل الحلقات O المانعة للتسرب في الجزء الأمامي والخلفي من حامل الماصة لتقليل الانجراف والحفاظ على الشفط القوي. استبدل الماصة بأخرى مملوءة حديثا.
- اخفض الماصة في حمام غرفة التسجيل.
- حدد موقع طرف الماصة في منتصف مجال الرؤية. تأكد من خلو الطرف من فقاعات الهواء أو الحطام الآخر.
- قم بتطبيق خطوة الجهد (5 مللي فولت) في اختبار الغشاء لمراقبة مقاومة الماصة. استمر في مراقبة مقاومة الإدخال خلال العملية الكاملة لتشكيل ختم على الخلية.
- قم بإلغاء إمكانات إزاحة الماصة، بحيث يقرأ تيار الماصة صفرا في وضع اختبار الغشاء ل pClamp.
- تصحيح سعة الماصة باستخدام وظيفة تعويض السعة السريعة على مضخم التصحيح المشبك (أقراص Cp السريعة في اللوحة الناعمة Multiclamp Commander).
- حرك الماصة لأسفل إلى الخلية.
- بمجرد أن تكون الماصة قريبة بدرجة كافية من الخلايا العصبية، قم بالتبديل إلى هدف التكبير الأعلى وأرسل الصورة عبر الكاميرا إلى شاشة (استخدم هدفا 40x، وتكبير إجمالي 400x). اضبط الماصة وأعد توسيط الخلايا العصبية.
- حرك قطب التسجيل بالقرب من السوما. حدد موقع مركز الخلايا العصبية على الشاشة وضع قطب التسجيل فوق الخلايا العصبية.
- اقترب من الخلايا العصبية من الأعلى ، بحيث يهبط القطب في وسط الخلية الكروية. اضبط إزاحة الماصة على صفر إمكانات التيار المستمر الثابتة في النظام.
- ضع الماصة بالقرب من الغشاء. تهبط بقوة على وسط الخلية.
ملاحظه: عند الهبوط ، سيحدث تنقر صغير على سطح الخلايا العصبية ومضاعفة / ثلاثة أضعاف مقاومة الإدخال.
- استخدم الضغط السلبي (الشفط) باستخدام حقنة أو ماصة فمية. قم بتشغيل إمكانية الاحتفاظ ب -60 مللي فولت. يجب أن تزداد مقاومة الختم حتى تمر ب giga-ohm.
ملاحظه: اعمل بسرعة لتقليل الوقت بين ملء القطب الكهربائي والهبوط على الخلية. هناك وقت محدود قبل أن يصل الأمفوتريسين المضاف إلى المحلول الداخلي المثقوب إلى طرف القطب. بمجرد تلوث الطرف بالأمفوتريسين ، يصعب تكوين أختام عالية المقاومة ، وغالبا ما تستقر المقاومة إلى ~ 200 ميغا أوم.
- بمجرد تشكيل ختم جيجا أوم ، حرر الضغط السلبي. بمجرد تشكل مانع التسرب، قم بتطبيق تعويض السعة السريع لتقليل سعة عابرات سعة الماصة في وضع اختبار الغشاء قدر الإمكان.
- عندما يبدأ الأمفوتريسين في العمل ، راقب مقاومة الإدخال تتناقص ببطء ويزداد التيار المتدفق استجابة لخطوة الجهد 5 مللي فولت تدريجيا مع دخول الأمفوتريسين إلى الغشاء. يشير الانخفاض المفاجئ في مقاومة السلسلة بدلا من الاستقرار التدريجي إلى حدوث تمزق تلقائي.
- قم بتقدير سعة الخلية بأكملها ومقاومة السلسلة باستخدام وظيفة التفريغ العابر بالسعة لمكبر الصوت. توثيق ومراقبة مقاومة السلسلة في بداية التجربة وأثناءها بانتظام.
ملاحظه: يمكن أن تستغرق مقاومة السلسلة من 5 إلى 20 دقيقة حتى تستقر ، اعتمادا على حجم القطب الكهربائي ومقدار المحلول النظيف الذي يتم سحبه في الماصة. يمكن استخدام أوضاع مشبك الجهد والمشبك الحالي بمجرد استقرار مقاومة السلسلة أقل من 30 ميغا أوم. في بعض الأحيان لوحظ تورم أو تقلص الخلايا العصبية أثناء التسجيل ، ولكن نادرا ما يتم ضبط الأسمولية ودرجة الحموضة في المحاليل بشكل صحيح.