تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. تسجيل مشبك التصحيح المزدوج وملء Biocytin
اعتمادا على نوع الاتصال المشبكي ، يتم استخدام ثلاثة طرق مختلفة للعثور على الخلايا العصبية المقترنة متشابكيا. إذا كان احتمال الاتصال منخفضا (كما هو متوقع لمعظم الاتصالات المثيرة) ، فتابع ما يلي:
- الوصلات العصبية ذات الاتصال المنخفض
- املأ الماصات بمحلول داخلي للتركيبة المدرجة في الجدول 1. بالنسبة لجميع التسجيلات في تكوين الخلية بأكملها ، أضف البيوسيتين بتركيزات تتراوح بين 3 - 5 مجم / مل إلى المحلول الداخلي (الماصة) للحصول على نتائج تلطيخ جيدة للخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي. دع البيوسيتين ينتشر في الخلية لمدة 15-30 دقيقة على الأقل (حسب حجم الخلية العصبية).
ملاحظة: لا تضيف البيوسيتين إلى المحلول المستخدم في الماصات "البحثية" المذكورة أدناه.
- قم بتصحيح خلية عصبية مفترضة بعد المشبكي في وضع الخلية بأكملها. استخدم ماصات رقعة ذات ساق طويلة ونحيلة. يسهل هذا القدرة على المناورة للماصة تحت الهدف ويقلل من القطع الأثرية للحركة التي قد تحدث عند إدخال القطب الكهربائي في الشريحة.
- بعد ذلك ، قم بتصحيح خلية عصبية محتملة قبل المشبكي في تكوين متصل بالخلية باستخدام ماصة رقعة "بحثية" بمقاومة 8-10 MΩ وقطر طرف صغير. تنشئ هذه الماصات رقعة "فضفاضة" متصلة بالخلية. املأ الماصة "البحثية" بمحلول داخلي يتم فيه استبدال K + ب Na + (الجدول 2) لمنع الخلايا العصبية من إزالة الاستقطاب أثناء البحث عن خلية ما قبل المشبكي.
ملاحظة: مقاومة الختم "السائبة" ليست في نطاق GΩ ولكن عادة ما تكون حوالي 30-300 MΩ.
- امسك إمكانات الغشاء تحت الختم "السائب" إلى حوالي -30 إلى -60 مللي فولت في وضع المشبك الحالي. بعد ذلك ، قم بتطبيق نبضات تيار كبيرة (0.2 - 2 نانو أمبير) لاستنباط جهد فعل في الخلية قبل المشابكي المحتملة. لاحظ إمكانات الفعل هذه كسنيبلات صغيرة على استجابة الجهد.
- اضبط تردد التحفيز على 0.1 هرتز لمنع انخفاض استجابة ما بعد المشبكي. استخدم ترددات تحفيز أقل إذا كانت أنسجة المخ غير ناضجة جدا أو لم يكن الاتصال المشبكي موثوقا به للغاية.
- في حالة عدم استجابة الخلايا العصبية "بعد المشبكي" لتحفيز الخلايا العصبية "قبل المشبكية" التي تم اختبارها ، قم بتصحيح خلية عصبية جديدة في وضع الختم "السائب". لا تستبدل قطب التصحيح "البحث" طالما تم إنشاء مانع التسرب بمقاومة >30 MΩ. بهذه الطريقة ، اختبر ما يصل إلى 30 خلية عصبية محتملة قبل المشبكي.
ملاحظه: لمنع إتلاف الخلايا العصبية أثناء إجراء البحث باستخدام مشبك رقعة فضفاض ، يجب تطبيق الشفط اللطيف فقط على ماصة البحث مقارنة بتلك المطبقة على ماصة التصحيح كاملة الخلية.
- إذا أدى التحفيز في وضع الختم "السائب" إلى EPSP / IPSP (إمكانات ما بعد المشبكي المثيرة / إمكانات ما بعد المشبك المثبطة) بزمن انتقال <5 مللي ثانية في الخلايا العصبية بعد المشبكي ، فقم بإزالة الماصة "البحثية" من الخلايا العصبية قبل المشبكي.
- استبدل ماصة التصحيح "البحثية" بقطب رقعة مملوء بمحلول داخلي منتظم يحتوي على البيوسيتين. تأكد من أن ماصة تصحيح التسجيل هذه تتمتع بمقاومة تتراوح من 4 إلى 8 MΩ ؛ كلما زاد حجم SOMA ، انخفضت مقاومة القطب.
- قم بتصحيح الخلايا العصبية قبل المشبكية وسجلها في وضع المشبك الحالي للخلية بأكملها. استنباط إمكانات العمل عن طريق الحقن الحالي في الخلايا العصبية قبل المشبكية وتسجيل استجابة ما بعد المشبكي. قم بتخزين البيانات على جهاز كمبيوتر لتحليلها لاحقا دون اتصال.
< p class = "jove_content" >
الجدول 1. محلول ماصة كلوريد منخفض.
المليمتر
جم / لتر
جم / 50 مل
ك-غلوكونات
135 ريال
31.622 دولار
1.5811 دولار
كيه سي إل
4
0.298
0.0149
هيبس
10
2.384 دولار أمريكي
0.1192
فوسفوكرياتين
10
2.552 دولار
0.1276
ATP-Mg2+
4
2.028 دولار
0.1014
جي تي بي-نا
0.3
0.156
0.0078
اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 باستخدام KOH
الأسمولية ~ 300 مللي أوسمول / لتر
أضف 3 - 5 مجم / مل من البيوسيتين
< p class = "jove_content" >
الجدول 2. محلول ماصة عالية Na للبحث عن الخلايا العصبية المقترنة متشابكية.
المليمتر
جم / لتر
جم / 50 مل
Na-غلوكونات
105
22.92 دولار
1.146 [إك]
كلوريد الصوديوم
30
1.76
0.088
هيبس
10
2.384 دولار أمريكي
0.1192
فوسفوكرياتين
10
2.552 دولار
0.1276
ATP-Mg2+
4
2.028 دولار
0.1014
جي تي بي-نا
0.3
0.156
0.0078
اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم
الأسمولية ~ 300 مللي أوسمول / لتر
