تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة على العقد الجذرية الظهرية للفئران السليمة

الملخص

المصدر: Gong ، K. ، et al. تسجيلات مشبك التصحيح على العقد الجذرية الظهرية السليمة من الفئران البالغة. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو فحص استثارة الخلايا العصبية الحسية في العقد الجذرية الظهرية باستخدام تقنية مشبك التصحيح لقياس القدرة على الريوباز والغشاء ، وتحليل استجابات الخلايا العصبية لحقن التيار المتزايد.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوان المناسبة.  

< p class = "jove_title" >1. تسجيلات مشبك التصحيح

1. ضع محلول القطب الكهربائي (انظر الجدول 1) على الجليد لمنع التدهور. املأ الماصة الزجاجية بمحلول مفلتر داخل الخلايا (مرشح الحقنة، حجم المسام: 0.2 ميكرومتر) وضع الماصة في حامل ماصة المرحلة الأمامية. ضع ضغطا لطيفا وإيجابيا على الماصة من خلال حقنة سعة 5 مل عن طريق إزاحة المكبس بحوالي 1 مل قبل إنزال الماصة في محلول الحمام.
   ملاحظة: هذا يمنع انسداد الماصة.
2. اختر وضع "V-clamp" عن طريق تدوير مقبض الوضع على مكبر الصوت ، ثم افتح واجهة "اختبار الغشاء" في البرنامج. حرك الماصة بالقرب من الخلايا العصبية المستهدفة تحت الفحص المجهري.
   ملاحظه: في مستحضر DRG السليم ، تقوم طبقة رقيقة من الخلايا الدبقية الساتلية بتغليف كل خلية عصبية.
3. استخدم ضغطا إيجابيا من الماصة لاجتياز طبقة الخلايا الدبقية عبر القمر الصناعي حتى يتم ملاحظة تضخم مفاجئ للمسافة بين الخلايا العصبية والطبقة المحيطة بها من الخلايا الدبقية الساتلية. استمر في تحريك الماصة نحو الخلايا العصبية حتى يتم ملاحظة "غمازة" على الخلايا العصبية.
   ملاحظه: بالمقارنة مع التسجيلات من الخلايا العصبية المنفصلة ، يجب أن يكون الضغط الإيجابي أكبر قليلا ، مما سيساعد على اختراق طبقة الخلية الدبقية عبر القمر الصناعي وزيادة فرص الترقيع الناجح.
4. تقليل الضغط الإيجابي. بعد ذلك ، حقق ختم جيجا أوم بشفط لطيف.
   ملاحظه: بهذه الطريقة ، يكون معدل نجاح التسجيل 70٪ على الأقل.
5. الحصول على تكوين تسجيل الخلية بأكملها كما هو موضح سابقا.
   1. اخترق غشاء الخلية العصبية لفترة وجيزة عن طريق شفط قصير ولكنه قوي. بدلا من ذلك ، استخدم وظيفة "الانطلاق" في مكبر الصوت أثناء تطبيق الشفط.
   2. بمجرد إنشاء وضع الخلية الكاملة ، قم بتعويض سعة الخلية بأكملها ومقاومة السلسلة (Rs) عن طريق تدوير مقابض تعويض السعة والمقاومة على مكبر الصوت.
      ملاحظه: روبية عادة ما تكون 5-20 MΩ.
   3. اترك الخلية إذا كان Rs أكبر من 30 MΩ في البداية أو تغير بأكثر من 20٪ أثناء التسجيل. أيضا ، قم بقياس إمكانات غشاء الراحة ؛ التخلي عن الخلية إذا كانت أكثر من -50 مللي فولت.
6. أغلق نافذة "اختبار الغشاء". اختر وضع "I-clamp normal" عن طريق تدوير مقبض الوضع على مكبر الصوت.
7. انقر فوق "فتح البروتوكول" في البرنامج ، وحدد وقم بتحميل البروتوكول لقياس قاعدة متغيرة. انقر فوق "تسجيل" لبدء التسجيل. قم بقياس مقاومة المدخلات والقاعدة الريوية لفحص استثارة الخلايا العصبية عن طريق حقن سلسلة متدرجة من التيارات المزيلة للاستقطاب بخطوات 100 باسكال باسكال
   1. انقر فوق "فتح البروتوكول" في البرنامج ، وحدد وقم بتحميل البروتوكول لقياس قاعدة متغيرة. انقر فوق "تسجيل" لبدء التسجيل. قم بقياس مقاومة المدخلات والقاعدة الريوية لفحص استثارة الخلايا العصبية عن طريق حقن سلسلة متدرجة من التيارات المزيلة للاستقطاب بخطوات 100 باسكال باسكال
   2. استخدم برنامج الحصول على البيانات وتحليلها (على سبيل المثال ، Clampfit) لتحليل الآثار المسجلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يحسب البرنامج مقاومة الإدخال (Rin) بناء على علاقة I-V للحالة المستقرة أثناء تيارات الاستقطاب المفرطة التي يتم تسليمها. حرك المؤشر لقياس قيمة عتبة القاعدة الريوية والغشاء. ملاحظه: يتم تعريف سعة التيار المطلوب لتحفيز AP على أنها قاعدة الريوباز ، ويتم تعريف أدنى جهد لتحفيز AP على أنه عتبة الغشاء.
8. سجل التيارات التي يسببها الترابط.
   1. املأ الماصة بناهضات محددة.
      ملاحظة: في التقرير الحالي ، استخدمنا 100 ميكرومتر من الغلوتامات و 100 ميكرومتر AITC للحث على التيارات بوساطة مستقبلات الغلوتامات ومستقبلات TRPA1 على التوالي.
   2. افحص الماصة للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء بالداخل. ضع الماصة في حامل الماصة. قم بتوصيل حامل الماصة بأنبوب متصل بنظام صرف الأدوية.
   3. استخدم المعالج لتحريك الماصة في حدود 50 ميكرومتر من الخلية العصبية. اضبط ضغط نظام صرف الدواء على 1 رطل لكل بوصة مربعة والمدة على 1 ثانية. قم بتبديل وضع التسجيل إلى مشبك الجهد ، وقم بتثبيته عند -70 مللي فولت. قم بالضغط لفترة وجيزة عبر نظام صرف الدواء لتسجيل التيار الناجم عن الدواء.

< p class = "jove_content" > الجدول 1

100 مل من المحلول داخل الخلايا التركيز (مللي متر) مكون ميغاواط ز 130 كغلوكونات 234.24 دولار 10 كيه سي إل 74.55 دولار 10 هيبس 238.3 [إ] 10 EGTA 2 MgCl₂ * 6 ساعات₂O 203.3 [م] الملاحظات: اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام KOH ، والأسمولية إلى 260 - 280 ملي أسمول مع السكروز والماء المقطر. أضف 2 ملي مولار MgATP ، 0.5 ملي Na₂GTP وقم بالفلتر قبل الاستخدام الفوري.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ماصة زجاجية سوتر BF150-110-7.5 رسا جهاز هافارد 64-0250 قم بتثبيت DRG لتجنب الانجراف. مضخة تمعجية WPI مجتذب الماصة سوتر ص 97 مكبر الأجهزة الجزيئية أكسوباتش 200 ب محول الأرقام الأجهزة الجزيئية 1440 د مجهر نيكون FN600 مناور دقيق سوتر إم بي سي 200 الكربوجين (95٪ O2 ، 5٪ CO2) مورد الغاز الطبي المحلي