$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. اختيار
- لجميع التجارب ، استخدم ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة (8 أسابيع) كنموذج حيواني.
ملاحظة: تظهر الفئران C57BL / 6J التي تحمل نوعا من لصق Cdh23 شيخوخة متسارعة في الجهاز السمعي ، تنعكس على أنها فقدان بنسبة 40٪ من نقاط الاشتباك العصبي الشريطية عند المنعطف القاعدي للقوقعة وخسارة بنسبة 10٪ في المنعطف الأوسط بحلول 6 أشهر من العمر ، تليها زيادة سريعة في هذه الخسارة في القوقعة بأكملها مع تقدم العمر. وبالتالي ، ننصح بتوخي الحذر عند استخدام الفئران C57BL / 6J التي يزيد عمرها عن 6 أشهر للبحث السمعي. يمكن استخدام سلالات أخرى من الفئران اعتمادا على أهداف تجريبية محددة.
- افحص الفئران باستخدام منظار الأذن الجيبي التشخيصي الاحترافي لاستبعاد أمراض الأذن الخارجية أو الوسطى قبل تقييمات السمع. قد تشمل العلامات المحتملة سائلا أو صديدا في القناة السمعية الخارجية ، واحمرار وتورم في الأنسجة المحلية ، وانثقاب الغشاء الطبلي.
ملاحظة: على الرغم من أن هذا نادرا ما يتم مواجهته ، إلا أنه بمجرد تحديده ، يجب استبعاد الفئران المصابة بأمراض الأذن الخارجية أو الوسطى.
2. تقييم السمع
- تخدير الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق لخليط من هيدروكلوريد الكيتامين (100 مجم / كغ) وزيلازين هيدروكلوريد (10 مجم / كجم). احكم على عمق التخدير من خلال المنبهات المؤلمة (على سبيل المثال ، منعكس قرصة إصبع القدم).
ملاحظة: عندما يكون منعكس قرصة إصبع القدم غائبا تماما ، يكون قد وصل إلى عمق مناسب للتخدير للاختبار السمعي. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الوقت لتسجيلات ABR (الاستجابة السمعية لجذع الدماغ) الثنائية، فقم بإعطاء جرعة أقل (خمس الجرعة الأصلية) من التخدير لاستعادة مستوى التخدير الأصلي. احرص على تجنب جرعة زائدة من التخدير ، فقد يؤدي ذلك إلى وفاة الفئران.
- حافظ على درجة حرارة جسم المخدر عند 37.5 درجة مئوية باستخدام وسادة تسخين منظمة للحرارة. ضع المخدر في غرفة محمية كهربائيا وصوتيا لتجنب التداخل طوال اختبار السمع.
ملاحظة: حافظ على درجة الحرارة الفسيولوجية أثناء العملية بأكملها حتى يستيقظ تماما لمنع الوفاة الناجمة عن انخفاض حرارة الجسم بعد التخدير.
- ضع أقطاب الإبرة تحت الجلد (20 مم ، 28 جم) عند رأس الجمجمة (قطب التسجيل) ، في المنطقة النكفية المماثلة أسفل صيوان الأذن المقاسة (القطب المرجعي) ، وفي المنطقة النكفية المقابلة (القطب الأرضي) ، بعمق 3 مم تحت جلد رأس الفأر ، على التوالي.
- استخدم مكبر صوت مغلق المجال لإجراء التحفيز الصوتي عبر أنبوب بلاستيكي بطول 2 سم بطرف مخروطي الشكل. ضع الطرف في قناة الأذن الخارجية.
ملاحظة: تأكد من أن المعاوقة الكهربائية في أقطاب التسجيل والمرجع أقل من 3 كيلو أوم (عادة 1 كيلو أوم). إذا كانت المعاوقة عالية ، فقم بتغيير موقع إدخال القطب ، أو تنظيف القطب بالكحول ، أو استبدال القطب لتجنب التغيرات في سعة موجة ABR.
- لتسجيل ABR ، قم بإنشاء نقاط نغمة (مدة 3 مللي ثانية ، أوقات صعود / هبوط 1 مللي ثانية ، بمعدل 21.1 / ثانية ، التردد: 4-48 كيلو هرتز) وتقديمها عند مستويات ضغط الصوت المتناقصة (SPLs) من 90 إلى 10 ديسيبل في خطوات 5 - 10 ديسيبل SPL. خلال هذه الخطوة ، يتم تضخيم الاستجابات (10,000 مرة) ، وتصفيتها (0.1-3 كيلو هرتز) ، ومتوسطها (1,024 عينة / مستوى تحفيز).
ملاحظة: تجمع ABRs لكل مستوى من مستويات التحفيز في خطوات dB 10، مع خطوات إضافية قدرها dB 5 بالقرب من العتبة.
- عند كل تردد ، حدد عتبة ABR ، والتي تشير إلى الحد الأدنى من SPL مما يؤدي إلى تسجيل ABR موثوق به مع موجة واحدة أو أكثر يمكن تمييزها والتي يمكن تحديدها بوضوح عن طريق الفحص البصري.
ملاحظة: عادة ما يكون من الضروري تكرار العملية لمصابيح SPLs المنخفضة حول العتبة لضمان اتساق أشكال الموجة. عتبة الاستجابة هي أدنى مستوى تحفيز يمكن عنده ملاحظة شكل الموجة عندما يؤدي انخفاض قدره 5 ديسيبل إلى اختفاء شكل الموجة.
فئة
3. معالجة أنسجة القوقعة
الصناعية
- بعد تسجيل ABR ، قم بالقتل الرحيم للفئران المخدرة عن طريق خلع عنق الرحم ، وقطع رأسها ، وفضح الفقاعات من الجانب البطني ، وافتحها بمقص حاد للوصول إلى القوقعة.
- باستخدام ملقط دقيق ، قم بإزالة العظام الصدغية ، وقطع شريان الركاب ، وإزالة الركاب من النافذة البيضاوية ، وتمزيق غشاء النافذة المستدير. اصنع ثقبا صغيرا في قمة القوقعة عن طريق تدوير طرف الإبرة برفق (13 مم ، 27 جم).
- قم بإصلاح العظام المعزولة بنسبة 4٪ (بالوزن / الحجم) بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.1 M (PBS ، درجة الحموضة 7.4) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة ذات رؤوس دقيقة ، قم بغسل المثبت برفق عبر الفراغات المحيطة باللمف عبر التطبيق على النوافذ البيضاوية أو المستديرة (كمدخل) والفتحة عند القمة (كمخرج).
ملاحظة: تتطلب بعض البروتينات فترة قصيرة من التثبيت لتجنب تدمير حواتمها من أجل وضع العلامات المناعية. في مثل هذه الحالات ، احتضان العظام في 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ساعتين ، اعتمادا على تعليمات الشركة المصنعة للكيمياء المناعية. يمكن أيضا إجراء التثبيت عن طريق التروية القلبية لإزالة دم القوقعة ، وتجنب ضوضاء الخلفية بسبب التلوين غير المحدد في مراحل لاحقة ، خاصة في نماذج الفئران لاعتلال القوقعة السنوية.
- اشطف العظام ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 0.1 M بارد من PBS لإزالة بقايا بارافورمالدهيد. قم بفك تكلس العظام بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك بنسبة 10٪ (EDTA) إما عند RT لمدة 4 ساعات أو عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة عن طريق الرج اللطيف في شاكر أفقي عند 20 دورة في الدقيقة. يمكن تحديث EDTA في منتصف الطريق.
ملاحظة: تخضع أوقات إزالة الكلس لتركيز EDTA وتفضيلات المستخدمين. يجب أن تحافظ الأنسجة منزوعة الكلسات على درجة معينة من المتانة ، مما يسهل التلاعب بعزل حوامل القوقعة الصناعية الكاملة في الخطوات اللاحقة. يمكن إزالة الكلس من العظام الصدغية بنسبة 10٪ EDTA مع الدوران ، مما يسمح للباحثين بمغادرة المختبر بعد اختبارات ABR وتجارب التثبيت. وقت إزالة الكلس مرن في نطاق 20 إلى 30 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- انقل عظمة زمنية واحدة منزوعة الكلس من EDTA إلى 0.1 M PBS. استخدم ملقط دومون # 3 و # 5 وإبرة 27 جم لتشريح مناطق القمية والوسطى والقاعدية بدورها ثم تشريح القوقعة من العظم تحت مجهر تشريح الاستريو. قم بعمل سلسلة من الجروح الصغيرة على طول الرباط الحلزوني باستخدام شفرة حلاقة ، وقم بإزالة الغشاء الصدري وغشاء ريسنر (الشكل 1).
ملاحظة: طالما أن القوقعة التي تم تشريحها سليمة ، يمكن تعديل هذه العملية وفقا للبروتوكول المعتاد للمشغل الفردي.
- قم بتشريح الظهارة السمعية المتبقية بما في ذلك الأطراف الحلزونية إلى منعطفات قوقعة صناعية فردية (القمة والوسط والقاعدة مع منطقة الخطاف) لمستحضرات التثبيت الكاملة.
- تحت هدف زيت 40x من المجهر الضوئي ، قم بقياس طول الغشاء القاعدي بمقياس 250 ميكرومتر يوضع في العدسة ، والذي يمكن تعديله على طول الأهداب المجسمة في IHCs.
- احسب طول كل دورة قوقعة صناعية عن طريق إضافة جميع أطوال المقطع (250 ميكرومتر لكل قطعة) ، واحصل في نفس الوقت على الطول الكلي للغشاء القاعدي عن طريق جمع أطوال كل دورة.
- قم بتحويل الطول الكلي للغشاء القاعدي، بما في ذلك منطقة الخطاف، إلى نسبة مئوية بناء على المسافة من قمة القوقعة الصناعية (0٪ تشير إلى قمة القوقعة، و100٪ إلى قاعدة القوقعة الصناعية).
- قم بتحويل هذه المسافة إلى تردد مميز للقوقعة الصناعية باستخدام دالة لوغاريتمية (d (٪) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f) ، بميل 1.25 مم / أوكتاف من التردد ، حيث d هي المسافة الطبيعية من قمة القوقعة الصناعية في النسبة المئوية ، f هي التردد بالكيلوهرتز) ، كما هو موضح سابقا. وبالتالي يمكن الحصول على نطاق التردد في منطقة مقابلة من الغشاء القاعدي في كل منعطف قوقعة.
فئة
4. تلطيخ التألق المناعي
- بعد التشريح ، ضع كل منعطف قوقعة صناعية في أنبوب طرد مركزي منفصل سعة 2.5 مل واحتضان لفات القوقعة الصناعية في مصل الماعز بنسبة 10٪ / PBS / 0.1٪ Triton X-100 لمدة ساعة واحدة في RT على المدور.
- قم بإزالة محلول الحجب / النفاذية أعلاه من كل أنبوب باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر تحت مجهر تشريح واحتضان العينات بالأجسام المضادة الأولية المخففة في مصل الماعز بنسبة 5٪ / PBS / 0.1٪ Triton X-100 طوال الليل عند 4 درجات مئوية على المدور.
ملاحظة: للوضع المناعي على شرائط القوقعة المشبكية ، استخدم بروتين الربط الطرفي للفأر قبل المشبكي المضاد للكربوكسيل 2 IgG1 (CtBP2 ، تسمية المجال B لبروتين السقالات RIBEYE ، 1: 400) ومستقبلات الفأر المضادة للجلوتامات 2 IgG2a (GluR2 ، تسمية وحدة فرعية من حمض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic أو مستقبلات AMPA ، 1: 200).
- اشطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 0.1 M PBS بارد لإزالة الأجسام المضادة الأولية المتبقية واحتضان العينات بالأجسام المضادة الثانوية المخففة في مصل الماعز بنسبة 5٪ / PBS / 0.1٪ Triton X-100 في RT لمدة 2-20123 ساعة في الظلام على الدوار.
ملاحظة: قم بإعداد مخاليط الأجسام المضادة الثانوية المناسبة باستخدام الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 568 (IgG1 ، 1: 500) والماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 488 (IgG2a ، 1: 500) ، والتي تكمل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الخطوة 4.2. لتحسين كفاءة وضع العلامات على الأشرطة المشبكية ، نوصي باختيار أجسام مضادة ثانوية محددة. تقوم بعض المختبرات بتمديد الحضانة بالأجسام المضادة الثانوية لزيادة وضع العلامات المناعية ل GluR2.
- اشطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 0.1 M PBS لإزالة الأجسام المضادة الثانوية المتبقية ونقل العينات من أنابيب الطرد المركزي سعة 2.5 مل إلى ألواح 35 مم تحتوي على 0.1 M PBS.
- ضع قطرة من وسط التثبيت الذي يحتوي على 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) على الشريحة وانقل العينات من PBS إلى وسط التثبيت. ضع إحدى حواف الغطاء على الشريحة وحررها للسماح للغطاء بالسقوط برفق.
ملاحظة: للتأكد من أن خلايا الشعر متجهة لأعلى وعدم حدوث طي أو التواء لعينات القوقعة الصناعية أثناء الإجراء، قم بتركيب عينات القوقعة الصناعية تحت مجهر تشريح مجسم.
- ضع الشرائح في صندوق منزلق عند 4 درجات مئوية طوال الليل للسماح للشرائح بالجفاف ثم تصويرها تحت مجهر ليزر متحد البؤر.
< p class = "jove_title" >
5. التقييم المورفولوجي لنقاط الاشتباك العصبي الشريطية للقوقعة الصناعية
- شرائح الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر بثلاثة ليزر - الصمام الثنائي للأشعة فوق البنفسجية 405 نانومتر ، وليزر الأرجون 488 نانومتر ، وليزر الحالة الصلبة (DPSS) بضخ الصمام الثنائي 561 نانومتر لإثارة DAPI (طيف الإثارة 409-464 نانومتر) ، Alexa Fluor 488 (طيف الإثارة 496-549 نانومتر) و Alexa Fluor 568 (طيف الإثارة 573-631 نانومتر) ، على التوالي.
- احصل على مداخن z متحدة البؤر على مسافة 8 ميكرومتر من كل منعطف للقوقعة الصناعية باستخدام عدسة غمر بالزيت عالية الدقة 63x.
ملاحظة: بمجرد التعريف ، يجب حفظ جميع معلمات رقمنة الصور المجهرية وتطبيقها بشكل موحد على جميع الشرائح.
- بالنسبة لعدد النقاط المشبكية ، اضبط مكدسات z (حجم الخطوة 0.3 ميكرومتر) لتمتد على طول خلايا الشعر الداخلية بالكامل (IHCs) ، وبالتالي ضمان إمكانية تصوير جميع النقاط المشبكية.
- ادمج الصور التي تحتوي على puncta في مكدس z للحصول على إسقاط المحور z، واستيرادها إلى برنامج معالجة الصور.
- اقسم الأعداد الإجمالية المشبكية في كل مكدس z في مناطق تردد محددة على عدد IHCs (يساوي الأعداد اليدوية النووية DAPI) لحساب عدد النقاط المشبكية لكل IHC. في كل منطقة تردد محددة ، قم بحساب متوسط جميع النقاط المشبكية في ثلاث صور لمجالات مجهرية مختلفة تحتوي على 9-11 IHCs.
- حدد منطقة الاهتمامات (ROIs) بما في ذلك المناطق القاعدية لكل شركة IHC باستخدام زر التحديد اليدوي. استخدم وظيفة القياس للقياس الكمي التلقائي للنقط ، ووظيفة مستجمعات المياه للتمييز بين البقع المتجاورة بشكل وثيق.
- بعد كل عد آلي ، قم بإجراء عمليات فحص بصرية مع تصحيحات يدوية لضمان موثوقية العد النقطي.
ملاحظة: يجب أن يظل المجربون أعمى بشأن ما إذا كانت الشريحة من القمة أو الوسط أو الدوران القاعدي للقوقعة.
- قم بتقييم البنية المشبكية وتوزيعها بصريا لعزل IHCs الفردية يدويا عن جيرانها بواسطة أداة القلم الرصاص (M) لتصور بنية الهيكل الخلوي وتوطين التشابك بشكل أفضل.
- لفحص تجاور شرائط ما قبل المشبكي (CtBP2) وتصحيحات مستقبلات ما بعد المشبكي (GluR2) ، استخرج مساحة voxel حول الشريط باستخدام أداة Rectangular Marquee Tool وعزل الشريط الفردي عن طريق الاقتصاص. من خلال النقر فوق Image > Image Size ، احصل على مجموعة مصغرة من هذه الإسقاطات المصغرة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المقترنة (ظهرت كأزواج متجاورة بشكل وثيق من CtBP2-positive و GluR2-positive puncta) مقابل الأشرطة اليتيمة (تفتقر إلى بقع مستقبلات الغلوتامات بعد المشبكي) (الشكل 2).
ملاحظة: تظهر نقاط الاشتباك العصبي القوقعية الطبيعية على شكل ملصقات مناعية مشتركة للشريط قبل المشبكي داخل خلية الشعر (anti-CtBP2) ورقعة مستقبلات الغلوتامات بعد المشبكي على الطرف العصبي السمعي (مضاد ل GluR2). تستخدم بعض المختبرات الإسقاطات متحدة البؤر جنبا إلى جنب مع النمذجة ثلاثية الأبعاد لتحديد حجم أو حجم التصحيح المشبكي. قبل الفقدان الكبير لمشابك الشريط ، من المحتمل أن تكون الأشرطة التي تظهر تغيرات في الحجم أو بدون بقع مستقبلات الغلوتامات المزدوجة مؤشرا على خلل وظيفي متشابك.
