تقييم تفاعلات الخلايا العصبية الجلوتاماتية وخلايا الورم الدبقي في ثقافة مشتركة

الملخص

المصدر: Fuchs، Q. et al. ، الزراعة المشتركة للخلايا العصبية الجلوتاماتيرجية وخلايا الورم الدبقي عالية الدرجة للأطفال في أجهزة الموائع الدقيقة لتقييم التفاعلات الكهربائية. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تقييم النشاط الكهربائي العصبي في ثقافة مشتركة للخلايا العصبية الجلوتامية القشرية المشتقة من hiPSC وخلايا الورم الدبقي باستخدام جهاز ميكروفيليديك مع مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. بروتوكول الثقافة المشتركة

1. اضبط يوم البذر وتركيز خطوط الخلايا UW479 و BT35 للوصول إلى 80٪ من الخلايا المتقاربة عند بدء الزراعة المشتركة ، وهو ما يعادل 21 يوما من الثقافة للخلايا العصبية الجلوتاماتيرجية.
2. قم بتربسين خلايا UW479 و BT35 وزرعها في الجزء العلوي من الخلايا العصبية الجلوتاميتية في كل جهاز مخصص للسوائل الدقيقة (بكثافة مستهدفة تبلغ 900 خلية / مم² لكل نوع من أنواع الخلايا) قبل زرع خلايا الأورام الدبقية عالية الدرجة للأطفال (pHGG) في جهاز الموائع الدقيقة الذي يحتوي على الخلايا العصبية الجلوتاماتية الناضجة.
3. الحفاظ على المزارع المشتركة لمدة يومين في بيئة خاضعة للرقابة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) مع الخلايا العصبية الجلوتاماتية Day11 وما بعده الوسط المفصل في الجدول 1.
4. عد خلايا pHGG باستخدام الصور المجهرية التي تم تحليلها باستخدام برنامج تحليل الصور لتقييم قابليتها للحياة. احسب النسبة المئوية للخلايا.
   ملاحظة: استخدم الصيغة التالية: 100 - ((عدد الخلايا في D23 / عدد الخلايا في D21) × 100).

< p class = "jove_title" >2. التسجيل الفيزيولوجي الكهربي

1. قم بإجراء التسجيل الفيزيولوجي الكهربي باستخدام نظام تجاري وبرامج متاحة تجاريا.
   ملاحظه: أجريت التجارب باستخدام مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA) تتكون من أقطاب كهربائية قطرها 30 ميكرومتر متباعدة بمقدار 100 ميكرومتر.
2. قم بإجراء أول تسجيل فيزيولوجي كهربي على الخلايا العصبية الجلوتاماتيرجية في D21 قبل بذر خلايا pHGG. استخدم الخلايا العصبية الجلوتاماتية المتمايزة كتحكم وزراعتها وحدها بالتوازي مع الثقافة المشتركة. قم بإجراء تسجيل ثان لكلا الحالتين كما هو موضح في الخطوة التالية المرقمة 3.
3. قم بإجراء تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية الثانية في D23 (بعد يومين من الزراعة المشتركة).

< p class = "jove_content" > الجدول 1: تكوين وسائط الثقافة للخلايا العصبية الجلوتاماتية المشتقة من hiPS.

مكونات وسط البذر D4 متوسط D7 متوسط D11 والمتوسط فصاعده DMEM / F-12 متوسط 0.5 ضعف 0.25 ضعف 0.125 ضعف Ø الوسط العصبي القاعدي 0.5 ضعف 0.25 ضعف 0.125 ضعف Ø BrainPhys المتوسطة Ø 0.5 ضعف 0.75 ضعفا 1x مكمل SM1 1x 1x 1x 1x ملحق N2 - أ 1x 1x 1x 1x Ala-Gln (GlutaMax) 0.5 ملي 0.5 ملي 0.5 ملي 0.5 ملي BDNF 10 نانوغرام / مل 10 نانوغرام / مل 10 نانوغرام / مل 10 نانوغرام / مل GDNF 10 نانوغرام / مل 10 نانوغرام / مل 10 نانوغرام / مل 10 نانوغرام / مل TGF-β1 1 نانوغرام / مل 1 نانوغرام / مل 1 نانوغرام / مل 1 نانوغرام / مل جيلتريكس 30 ميكروغرام / مل Ø Ø Ø مكمل البذر 1x Ø Ø Ø ملحق اليوم 4 Ø 1x Ø Ø

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 256MEA100 / 30iR-ITO-w / o MCS 256MEA100 / 30iR-ITO-w / o مسبار 40 ميكرومتر لعداد الصولجان دوتشر 53750 مسبار 60 ميكرومتر لعداد الصولجان دوتشر 51999 علاء جلن (جلوتاماكس) سيغما جي 8541 خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية الترمو: العلمية هيراسنوع KS12 الخلايا العصبية الجلوتاماتيرجيك القشرية برين إكسيل BX-0300 DMEM / F12 متوسط سيغما د8437 DPBS 1X دوتشر L0615-500 قوارير زراعة الخلايا EasYFlaskTM 75 سم 3 نونك 156499 مصل الأبقار الجنيني (FBS) دوتشر 500105 GDNF بيبروتك 450-10 جيلتريكس تقنيات الحياة A1413201 BDNF البشري بيبروتك 450-02 حاضنه ميمرت IC0150med MEA2100 MCS هاتف1205-MEA2100-11240 ماصة دقيقة P10 سارتوريوس LH-729020 ماصة دقيقة P100 سارتوريوس LH-729050 ماصة دقيقة P1000 سارتوريوس LH-729070 ماصة دقيقة P200 سارتوريوس LH-729060 Microtube Eppendorf 1,5 مل قفل آمن دوتشر 33290 المجرب متعدد القنوات MCS - ملحق N2 - أ الخلية الجذعية 7152 ريال الوسط العصبي القاعدي تقنيات الحياة 21103049 مكمل عصبي Neurocult SM1 الخلية الجذعية 5711 م الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) بدون L-glutamine دوتشر X0557-100 Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity دروموند 4000202/4038202 ماصة لزراعة الخلايا 10 مل فالكون® دوتشر 357551 ماصة لزراعة الخلايا 5 مل فالكون® دوتشر 357543 لوحة سائق (CultureTemp) بيلارت 370151000 بولي د-يسين سيغما ص 6407 مجهر بريموفرت زييس هاتف: 415510-1100-000