$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير الألياف البصرية (الشكل 1 أ)
- استخدم الألياف البصرية متعددة الأوضاع (قلب 105 ميكرومتر ، مكسوة بالزجاج مع قلب السيليكا ، 0.22 NA). قم بتجريد الكسوة 125 ميكرومتر من قلب الألياف باستخدام أداة متجرد دقيقة بينما لا تزال الألياف متصلة ببكرة الألياف.
- قطع الألياف بطول حوالي 2-3 سم باستخدام سكين ماسي.
- أدخل الألياف في حلقة عصا سيراميك زركونيا (المعرف: 126 ميكرومتر). يجب أن يبرز ما يقرب من 0.5-1 مم من الألياف الضوئية من الجانب المحدب من الطويق.
- باستخدام إبرة ، ضع قطرة واحدة من غراء الايبوكسي على طرفي الطويق ولكن ليس على جانبي الطويق. بدلا من ذلك ، استخدم الغراء الفائق.
- اترك الغراء يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- قم بتلميع الجانب المحدب من الطويق باستخدام فيلم تلميع ألياف الماس (فريك 3 ميكرومتر).
- اختبر دقة نقل الضوء باستخدام مقياس الطاقة البصرية.
- اضبط الطول الموجي على مقياس الطاقة على نفس الطول الموجي لليزر المستخدم.
- ضع سلك التصحيح بحيث يكون الطرف مواجها لمركز المستشعر. قم بتشغيل الليزر وقراءة ناتج الضوء من عداد الطاقة. سجل القيمة.
- قم بتوصيل الألياف الضوئية بسلك التصحيح عبر غلاف التزاوج وضعه مع طرف الألياف المواجه لمركز المستشعر. قم بتشغيل الليزر وقراءة ناتج الضوء من عداد الطاقة. سجل القيمة.
- احسب معدل الإرسال بقسمة القيمة الثانية على القيمة الأولى. إذا كان معدل الإرسال أقل من 0.5 ، فتخلص من الألياف ؛ خلاف ذلك ، استخدمه للزرع.
- اختبر معدل النقل لكل ألياف قبل الزرع.
- للتجارب اللاحقة ، اضبط ناتج شدة ضوء الليزر على معدل نقل الألياف البصرية: اضبط ناتج الضوء من طرف سلك التصحيح على 5-15 مقسوما على معدل الإرسال لتحقيق ناتج ضوء نهائي من طرف الألياف من 5-15 ميجاوات.
فئة
2. تحضير مصفوفات أسلاك التنغستن لتسجيلات LFP (الشكل 1 ب)
قم - بلصق العديد من أدلة أنبوب السيليكا (على سبيل المثال 6) 100 ميكرومتر بالتوازي مع الجانب اللزج لقطعة من الشريط. قطع قطعة واحدة ، حوالي 4-6 مم ، لتجميع مجموعة سلكية واحدة.
- خيط أسلاك التنغستن المعزولة فورمفار 45 ميكرومتر من خلال أنابيب التوجيه باستخدام الملقط.
- قم بإزالة ستة أسلاك ربط نحاسية دقيقة معزولة بالمينا (بطول 5 مم تقريبا) وسلك تأريض (بطول 2-3 سم تقريبا) باستخدام مشرط لكشط العزل على كلا الطرفين. لحامها على دبابيس الموصل النانوي.
- قم بتوصيل كل سلك ربط بسلك تنجستن واحد باستخدام قطرة واحدة من الطلاء الفضي الموصل ، على التوالي. اتركه يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- ضع الحد الأدنى من الأسمنت لتغطية الأسلاك. لا تضع الأسمنت على أسلاك التنغستن ، والتي سيتم إدخالها في أنسجة المخ ، أو على الجزء العلوي من موصل النانو. دع الأسمنت يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- قم بإجراء قطع زاوي (5-20 درجة) لأسلاك التنغستن باستخدام مقص غير حاد من الفولاذ المقاوم للصدأ لتمكين الزرع الموثوق به للأسلاك أسفل أو فوق المنطقة المجاورة للطبقة الهرمية ، حيث تكون سعة ثيتا منخفضة جدا لتقدير دقة الاتصال.
- قم بإزالة العزل عن طرف السلك الأرضي (حوالي 2 مم) باستخدام مشرط لكشط العزل. عالجها بالتدفق واللحام المسبق.
- تحقق من المحادثات المتقاطعة المحتملة بين الأقطاب الكهربائية باستخدام مقياس رقمي متعدد. قم بتوصيل دبابيس الموصل بجهاز القياس المتعدد، والذي يجب ضبطه على وضع قياس المقاومة. تحقق من المجموعات الزوجية للقنوات ؛ تشير القراءة على المقياس المتعدد أقل من 5 MΩ إلى الحديث المتبادل الكبير.
- استخدم مقياس المعاوقة للتحقق من مقاومة كل قطب كهربائي سلكي في محلول ملحي. قيم المعاوقة النموذجية أقل من 100 كيلو أوم.
- لتسهيل الزرع ، قم بلصق ألياف بصرية واحدة على مصفوفة الأسلاك بحيث يكون طرف الألياف على مستوى أقصر سلك ويكون طرف الألياف على مقربة ولكن لا يلمس أسلاك التنغستن. حافظ على زاوية الألياف صغيرة قدر الإمكان لمنع تلف الأنسجة أثناء الزرع.
< p class = "jove_title" >
3. الغرسات التجسيمية
- قم بإزالة النسيج الضام من أعلى الجمجمة وادفع عضلات الرقبة لأسفل بمقدار 2 مم تقريبا لمنع القطع الأثرية العضلية أثناء التسجيل.
- نظف الجمجمة باستخدام قضيب قطني ومحلول ملحي ، وحفر أربعة ثقوب (2 في الأمام واثنان فوق المخيخ ، قطر 0.8 مم) لوضع مسامير عظمية من الفولاذ المقاوم للصدأ (00-96 × 1 / 16) لتأريض الغرسة وتثبيتها (الشكل 1 د). ضع المسمار الأرضي المتصل بسلك نحاسي واحد (طوله حوالي 2-3 سم) فوق المخيخ.
- قم بتغطية المسمار الأرضي بالكامل بالأسمنت لمنع القطع الأثرية العضلية أثناء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. قم ببناء حلقة أسمنتية تربط جميع البراغي (الشكل 1E).
- إجراء حج القحف فوق جانب الزرع (الحصين ، AP -1.94 ، L 1.4 ، V 1.4 في إشارة إلى bregma). ضع ما يقرب من 5 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم على سطح أنسجة المخ.
- قم بخفض مصفوفة الأسلاك ببطء باستخدام التكساس التجسيمي في حج القحف. بالنسبة للتسجيلات الوحدوية ، قم بزرع مسبار سيليكون بدلا من مصفوفة سلكية. لمنع القطع الأثرية الضوئية الكهروضوئية ، قم بزرع الألياف الضوئية بشكل منفصل في الحصين بحيث لا يواجه طرف الألياف المسبار مباشرة (الشكل 1 ج - I). للتحقيق في تنسيق الاحتباس بين نصفي الكرة الأرضية ، قم بزرع ألياف بصرية إضافية في منطقة CA1 الحصين المقابلة.
- لحماية أنسجة المخ ، ضع ما يقرب من 5 ميكرولتر من الشمع السائل الدافئ / زيت البارافين ، المسخن مسبقا عند 70 درجة مئوية ، مع حقنة فوق موقع الزرع.
- ضع الأسمنت حول مجموعة الأسلاك وقم بتغطية الجمجمة بالأسمنت.
- ضع قطرة واحدة من التدفق على السلك الأرضي / المرجعي الملحوم مسبقا والسلك الملحوم مسبقا المتصل بالمسمار الأرضي باستخدام إبرة ، على سبيل المثال ، وقم بدمج الأسلاك باستخدام آلة لحام.
- قم بتغطية السلك الأرضي بالكامل بالأسمنت.
- يجب تطبيق 0.3 مل من الحمر (1:4 في كلوريد الصوديوم المعقم) والكاربروفين (5 ملغ/مل) بعد الجراحة ولمدة اليومين التاليين على الأقل. يستيقظ الفأر عادة في غضون 15 دقيقة بعد الجراحة. قم بتسخين بمصباح أحمر لتسريع الشفاء.
- راقب وزن الفأر يوميا في الأسبوع الأول بعد الجراحة أو حتى يستقر. يجب ألا يتجاوز فقدان الوزن 10٪ من الوزن المسجل للفأر قبل الجراحة. لتسريع استقرار الوزن ، قم بتزويد الفأر بالطعام الرطب والحليب المكثف خلال الأيام الأولى بعد الجراحة.
- لتسجيل النشاط الخلوي للحصين أثناء الاحتباس ، قم بزرع مسبار سيليكون في الحصين (AP -1.94 ، L 1.4 ، V 1 ، مع الخفض اللاحق) (الشكل 1 ج - I). زرع الألياف البصرية في الحصين عند AP -3 ، L 1.4 ، V 1.6 ، 39 درجة الذيلية. إذا كان تحفيز الخلية somata مطلوبا ، فقم بزرع ألياف بصرية إضافية في MS (AP +0.98 ، L 1 ، V 3.9 ، 15 درجة جانبي).
