تقييم الوصلة العصبية العضلية الوظيفية عن طريق التحفيز البصري المتزامن وتسجيل الفيديو

الملخص

المصدر: Liberman، M.، et al.، هندسة وتوصيف نموذج بصري وراثي للتقاطع العصبي العضلي البشري. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم الوصلات العصبية العضلية الوظيفية. باستخدام مفاعل حيوي يحتوي على أنسجة عضلية وخلايا عصبية حركية ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري الفلوري ، يتم تحفيز القنوات الحساسة للضوء في الخلايا العصبية لتوليد إشارات كهربائية ، مما يتسبب في تقلصات ألياف العضلات.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير المفاعل الحيوي

1. اصنع قوالب المفاعلات الحيوية
   1. قم بتنزيل ملف CAD (تصميم بمساعدة الكمبيوتر) من ملف CAD التكميلي أو قم بإنشاء تصميم مخصص.
   2. قم بإنشاء مسار أدوات CNC (التحكم العددي بالكمبيوتر) من النموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج CAM (التصنيع بمساعدة الكمبيوتر).
   3. آلة قوالب الأسيتال باستخدام آلة الطحن CNC.
2. تصنيع المفاعلات الحيوية
   1. امزج قاعدة 10: 1 لخليط عامل المعالجة من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS ، 77 جم من الخليط لكل 4 منصات / قوالب).
   2. ضع الخليط في غرفة مفرغة ، وأغلق جميع الصمامات ، وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية ، وقم بإزالة الغازات من الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تختفي فقاعات الهواء. يسكب المزيج في قوالب ويزيل الغازات من القوالب في غرفة التفريغ لمدة 1 ساعة.
   3. أغلق القوالب مع النصف العلوي من القالب في الاتجاه الصحيح. ضع قضيبا سداسيا فولاذيا فوق المركز وقم بتثبيته على كلا الجانبين.
   4. أعد ملء الجزء العلوي ب PDMS.
   5. عالج القوالب في فرن 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل.
   6. قم بإزالة المنصات من القوالب بعد أن تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
   7. قم بتنظيف الأجهزة في حمام بالموجات فوق الصوتية باستخدام دورات ساعة واحدة من صابون الأطباق ، و 400 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ ، والماء المقطر.
   8. يجف طوال الليل عند 65 درجة مئوية.
   9. انقع الأغطية الزجاجية في بوليولول خافض للتوتر السطحي غير أيوني بنسبة 1٪ لمدة 30 دقيقة ، مع التأكد من عدم تكديسها بحيث يتم تغطيتها جميعا بشكل صحيح.
   10. يشطف جيدا بالماء المقطر ويجفف طوال الليل عند 65 درجة مئوية.
   11. عالج الأغطية الزجاجية ومنصة PDMS بمنظف البلازما على ارتفاع ب 6 لتر / دقيقة من الأكسجين لمدة 1-2 دقيقة. بمجرد المعالجة ، اربط الاثنين معا عن طريق الضغط على PDMS لأسفل على الغطاء لمدة 30 ثانية على الأقل.
   12. قم بتعقيم الأجهزة المرتبطة قبل إضافة الخلايا.

< p class = "jove_title" >2. بناء إعداد التحفيز البصري

1. باستخدام نظام مكعب قفص 30 مم ، قم بتوصيل مرآة ثنائية اللون 573 نانومتر في المنتصف. قم بإقران مصباح LED أحمر 627 نانومتر (الصمام الثنائي الباعث للضوء) مع مرشح إثارة طويل التمرير 594 نانومتر وقم بتوصيله بالجانب العلوي من المكعب ، بحيث يواجه مؤشر LED المرآة. ثم قم بتوصيل مصباح LED أزرق 488 نانومتر مع مرشح إثارة قصير التمرير 546 نانومتر بالجانب المجاور من المكعب ، بحيث يواجه مؤشر LED المرآة كما هو موضح في التخطيطي في الشكل 1 أ.
2. قم بتوصيل غشاء قزحية يتم تشغيله بواسطة حلقة في الجزء السفلي من مكعب القفص للتحكم في حجم المنطقة المضيئة.
3. قم بتشغيل كل مصباح LED باستخدام برنامج تشغيل T-Cube LED والتحكم عبر لوحة Arduino Uno Rev3. قم بتوصيل الإدخال الجانبي لبرنامج تشغيل LED بقابس مصدر الطاقة ، وقم بتوصيل الإخراج الأوسط ب Arduino ، وقم بتوصيل الإخراج الجانبي مباشرة بمصابيح LED.
4. قم بتوصيل Arduino Uno بجهاز كمبيوتر باستخدام كابل USB.
5. قم بتنزيل الملفات من رابط GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. افتح ملف "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" من مجلد GitHub.
7. تعيين معلمات البدء: الخطوات = 30 ؛ startFrequency = 0.5 ؛ endFrequency = 3 ؛ طول النبض = 100.
8. تأكد من تعيين خرج الدبوس 4 لبرنامج تشغيل Blue LED وتعيين إخراج الدبوس 2 لبرنامج تشغيل Red LED. تحقق من توصيل الأسلاك الوسطى لبرنامج تشغيل LED بالأرض وإخراج الدبوس المعني.
9. قم بتجميع وتحميل برنامج "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" إلى Arduino.
10. قم بتوصيل كل برنامج تشغيل LED بالقناة المقابلة له.

< p class = "jove_title" >3. إعداد ثقافة الخلية (اليوم -21-0)

1. خلايا العضلات الهيكلية الأولية
   1. قم بإذابة وتوسيع الخلايا العضلية الهيكلية الأولية (التي تم الحصول عليها من Cook Myosite) لمدة أقصاها ستة مقاطع باستخدام وسط النمو العضلي (+ الملحق). الحفاظ على الخلايا في حاضنة ضبط على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   2. قم بتغيير الوسائط كل يومين.
   3. بمجرد أن تتلاقى الخلايا حوالي 60٪ ، قم بتمريرها باستخدام 0.05٪ Trypsin-EDTA (1x ، لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية). اجمع الخلايا المنفصلة وأضف وسائط جديدة لتحييد التربسين.
   4. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم واستنشق المادة الطافية فوق حبيبات الخلية.
   5. أعد تعليق الخلايا باستخدام MGM والبذور 1: 3 مع 60 مل لكل قارورة ثلاثية الطبقات.
2. ChR2-hiPSC
   ملاحظه: تم إنشاء جميع خطوط الخلايا لهذا العمل واستخدامها وفقا للإرشادات المؤسسية لجامعة كولومبيا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية. في هذا البروتوكول ، تم إنشاء hiPSCs التي تعبر عن ChR2 عبر تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 باستخدام الطرق الموصوفة سابقا 18 ، ولكن يمكن استخدام أي خطوط خلايا بصرية وراثية مستقرة (عدسية ، piggyBac ، إلخ) بنفس الطريقة. تم اختيار المحفزات التأسيسية المعبر عنها في كل من iPSCs والخلايا العصبية الحركية (CAG). تم العثور على الخلايا لتلك الأنماط النووية الصحية ، كما هو مذكور في المنشورات السابقة.
   1. قم بتغطية الألواح المكونة من 6 آبار بسعة 1 مل / بئر من مصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان المخففة في DMEM / F12 (1:80) واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
   بذور
   2. iPSCs على لوحات 6 آبار مطلية مع 2 مل من وسط زراعة الخلايا الخالية من المغذيات (وسائط iPSC), تبادل 2 مل من الوسائط كل يومين والمرور كل 5-7 أيام. الحفاظ على الخلايا في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   3. المرور
      1. قم بفصل الخلايا الجذعية عن طريق احتضانها ب 1 مل من الكاشف المطلق للخلايا الجذعية الخالي من الإنزيم لمدة 4 دقائق وقصها ميكانيكيا باستخدام ماصة P1000 عريضة الطرف.
      2. خلايا البذور بنسبة 1:24 أو 1:48 في وسائط iPSC مع 2 ميكرومتر من Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد في 2 مل / بئر على ألواح 6 آبار مطلية.

< ص الفئة = "jove_title" >4. بذر أنسجة العضلات الهيكلية (اليوم -3)

1. عزل وعد 30 × 106 أرومة عضلية باستخدام عداد خلوي آلي.
2. أعد تعليق الخلايا العضلية في مزيج 4: 1 من 3 مجم / مل من الكولاجين الأول ومصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان (800 ميكرولتر من خليط الكولاجين + 200 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 1 مل). بالنسبة لمكون الكولاجين ، أضف عامل التحييد المصاحب (مزيج 9: 1 من الكولاجين إلى عامل تحييد) وقم بتخفيف الخليط باستخدام 1x PBS لتحقيق حجم 800 ميكرولتر.
3. أضف 15 ميكرولترا من تعليق الكولاجين الخلوي إلى كل غرفة عضلية في المفاعل الحيوي ، مع التأكد من نشر التعليق عبر كلا العمودين باستخدام طرف الماصة (الشكل 2).
4. دع خليط الخلية والهلام يتبلمر عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم املأ كل مفاعل حيوي جيدا ب 450 ميكرولتر من وسائط النمو العضلي.
5. بعد 3 أيام (بمجرد ضغط الجل) ، ابدأ في تمايز الأنبوب العضلي.

< p class = "jove_title" >5. تمايز الأنبوب العضلي (أيام 0-14)

1. ابدأ ضخ الأنبوب العضلي عن طريق تبديل الأنسجة إلى 450 ميكرولتر من الوسائط المحفزة للاندماج (FS، الجدول 1) لمدة 7 أيام، وتغيير الوسائط كل يوم.
   ملاحظه: حاول أن تبدأ في تمايز الأنبوب العضلي في نفس يوم تمايز الخلايا العصبية الحركية من hiPSCs من أجل زرع الخلايا العصبية الحركية في نهاية جداول التمايز لكلا النوعين من الخلايا.
2. في اليوم 7 ، قم بتغيير الوسائط إلى 450 ميكرولتر من وسائط النضج Ia (MMIa ، الجدول 1).
3. في اليوم 9 ، قم بالتغيير إلى 450 ميكرولتر من وسائط النضج Ib (MMIb ، الجدول 1).
4. في اليوم 11, تغيير الوسائط إلى 450 ميكرولتر من NbActiv4. استمر في تغيير الوسائط كل يومين حتى يتم زرع الخلايا العصبية الحركية (الخطوة 7).

< p class = "jove_title" >6. تمايز الخلايا العصبية الحركية (الأيام 0-14)

1. في اليوم 0 ، انقل 4 × 10⁶ ChR2- hiPSCs إلى طبق بتري مرفق منخفض للغاية مع 15 مل من وسط ثقافة تعليق الخلايا العصبية الحركية (MSCM ، الجدول 1). مكمل MSCM مع 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 0.2 ميكرومتر LDN193189 ، 40 ميكرومتر SB431542 هيدرات و 5 ميكرومتر Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد.
2. في اليوم 2 ، اعزل المجالات العصبية (NS) بمصفاة قابلة للانعكاس 37 ميكرومتر وأعد صفيحتها في 15 مل من MSCM مع 3 ميكرومتر CHIR99021 ، و 0.2 ميكرومتر LDN193189 ، و 40 ميكرومتر SB431542 هيدرات ، و 0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك. بعد اليوم 2 ، يجب أن يكون NS مرئيا في طبق بتري دون استخدام المجهر.
3. في اليوم 4 ، انقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب سعة 50 مل واسمح للمجالات العصبية بالاستقرار في القاع (5 دقائق). استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM مكملا ب 0.5 ميكرومتر SAG و 0.2 ميكرومتر LDN193189 و 40 ميكرومتر SB431541 و 0.1 ميكرومتر من حمض الريتينويك.
4. في اليوم 7 ، كرر الخطوة 6.3. ولكن أعد تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM مكملا ب 0.5 ميكرومتر SAG و 0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك.
5. في اليوم 9 ، كرر الخطوة 6.3. ولكن أعد تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM مكملا ب 10 ميكرومتر DAPT.
6. في اليوم 11 ، كرر الخطوة 6.3. ولكن أعد تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM مكمل ب 20 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF.
7. في اليوم 14 ، قم بزرع الخلايا العصبية الحركية في المنصة.

< ص الفئة = "jove_title">7. بذر الخلايا العصبية الحركية تتجمع في المفاعل الحيوي (اليوم 14)

1. قم بإعداد خليط جل 4: 1 من 2 مجم / مل من الكولاجين الأول و Matrigel (800 ميكرولتر من خليط الكولاجين + 200 ميكرولتر من Matrigel للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 1 مل). بالنسبة لمكون الكولاجين ، أضف عامل التحييد المصاحب (مزيج 9: 1 من الكولاجين إلى عامل تحييد) وقم بتخفيف الخليط باستخدام 1x PBS لتحقيق حجم نهائي يبلغ 800 ميكرولتر.
2. استخدم مصفاة خلية 400 نانومتر لتحديد المجالات العصبية الكبيرة وإعادة تعليقها في خليط الجل.
3. استنشق الوسائط من الخزان وبعناية من بئر الغلاف العصبي (الشكل 2).
4. أضف 15 ميكرولتر من خليط الجل إلى قناة الغلاف العصبي.
5. قم بتحميل ماصة سعة 10 ميكرولتر ب 10 ميكرولتر من الجل ثم اختر ماصة واحدة من الخلايا العصبية.
6. قم بإيداع NS في قناة الغلاف العصبي وتأكد من وجود NS في الغرفة. ارفع الماصة ببطء مع تحرير الجل المتبقي بمجرد ترسيب NS. إذا لم تكن متأكدا من ترسيب NS بشكل صحيح ، فتحقق من موقعه باستخدام المجهر.
7. اترك الجل يتبلمر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
8. إلى الخزانات ، أضف 450 ميكرولتر من NbActiv4 مكملا ب 20 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF.
9. قم بتغيير الوسائط كل يومين للسماح بالنمو المحوري من NS إلى الأنسجة العضلية.

فئة

8. التحفيز البصري المتزامن وتسجيل الفيديو لوظيفة NMJ (اليوم 24+)

1. للتصوير ، استخدم مجهر فلوري مقلوب مع كاميرا علمية تكميلية لأكسيد المعادن وأشباه الموصلات (sCMOS).
2. اضبط تجميع برنامج الكاميرا على 2x2 ، والتعرض إلى 20 مللي ثانية ، وتشغيل الغالق المتداول ، ومعدل القراءة على 540 ميجاهرتز ، والنطاق الديناميكي: 12 بت والكسب 1 ، ووضع المستشعر: التداخل.
3. استخدم هدفا 2x على المجهر لتصوير الأنسجة الدقيقة.
4. قم بتوصيل غرفة الخلايا الحية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) بمرحلة المجهر.
5. حدد منطقة الاهتمام (ROI) التي تحتوي على أنسجة الأنسجة الهيكلية المعصبة لتقليل حجم الملف ووقت المعالجة.
6. ضع مرشح انبعاث بطول 594 نانومتر بين العينة وهدف التصوير لتصفية نبضات الضوء الأزرق من الكاميرا.
7. ضع صفيحة مستطيلة الشكل مكونة من 4 آبار تحتوي على 4 مفاعلات حيوية (24 أنسجا) في حجرة الخلية الحية.
8. انقر على Live View. توسيط الصورة وتركيزها باستخدام عائد الاستثمار المطلوب.
9. قم بتحميل رمز الماكرو المخصص من مجلد GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) للتحكم في موضع المسرح ولوحة Arduino والحصول على الفيديو.
10. قم بتعيين إخراج الفيلم على day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. قم بتشغيل كود الماكرو مع إحداثيات X و Y المطلوبة الموضوعة على المسرح واحصل على فاصل زمني سريع مع 1700 إطار بمعدل 50 إطارا / ثانية.
12. استبدل الوسائط بعد التصوير وأعد العينات إلى الحاضنة. اترك 24 ساعة على الأقل بين جلسات الحصول على الصورة لتجنب إجهاد الأنسجة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تحفيز وتسجيل وتحليل وظيفة NMJ. (أ) تخطيطي لإعداد LED ومسار الضوء. (ب) الإعداد البصري باستخدام مجهر مقلوب ، وغرفة خلية حية ، ومرحلة آلية ، وكاميرا sCMOS. (ج) خوارزمية للمعالجة المجمعة لمقاطع فيديو التحفيز البصري لثقافات NMJ. (د) الإطار التمثيلي للفيديو الذي تم إنشاؤه بواسطة شفرة MATLAB والرسم البياني المقابل لتتبع ...

المواد