التحليل فوق البني لقسم دماغ الفأر باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Lutz, D., et.al. تقييم معلمات المرونة العصبية فوق البنية بعد نقل الرحم لدماغ الفأر النامي والحبل الشوكي. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو التحضير وتحليل المجهر الإلكتروني (TEM) لقسم الدماغ من جرو فأر. يبدأ البروتوكول بأنسجة ثابتة برباع أكسيد الأوزميوم مدمجة في الراتنج ، متبوعا بتشذيب دقيق لعزل منطقة الاهتمام وبضع الميكروويات الفائقة لإنتاج أقسام شبه رقيقة ورقيقة للغاية ، والتي يتم تصورها باستخدام الفحص المجهري الضوئي و TEM ، على التوالي.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. اختيار معلمات المرونة العصبية فوق البنية للتحليل الكمي

رسم خرائط لمنطقة الاهتمام
1. اختر منطقة اهتمام (على سبيل المثال ، الحصين أو المخيخ) وقم بتوطين المنطقة في أطلس القسم عن طريق اختيار الصورة من الأطلس الذي يحتوي على هذه المنطقة.
2. ارسم حدود المنطقة محل الاهتمام على صورة القسم وابحث عن حدود المنطقة هذه على عينة الراتنج.
3. ضع علامة على حدود منطقة الاهتمام (على سبيل المثال ، الحصين أو المخيخ) على عينة الراتنج ، باستخدام مقياس إبرة دقيقة (26 جم ، 1 بوصة).
4. قم بتسخين عينة الراتنج إلى 85 درجة مئوية في فرن لتليين الراتنج للتشذيب أو ، بدلا من ذلك ، استخدم جهاز تشذيب أو شفرة رفيعة أو ورق صنفرة.
5. استئصال منطقة الاهتمام من عينة الراتنج بشفرة حلاقة. قم بتركيب العينة على قضبان تثبيت من زجاج الأكريليك من العيار المطلوب (على سبيل المثال ، بقطر 8 مم وطول 1 سم) بالغراء. قم بقص العينة المركبة للتقسيم شبه الرقيق والرقيق.
6. قم بإعداد أقسام نصف رقيقة (0.75 ميكرومتر) ورقيقة جدا (70 نانومتر) من المنطقة المشذبة باستخدام ميكروتوم فائق: اضبطه على 1.5 مم / ثانية لسمك 0.75 ميكرومتر وعند 0.7 مم / ثانية لسمك 70 نانومتر.
7. اجمع الأقسام شبه الرقيقة على حاملات الزجاج وصمة عار الأقسام بنسبة 1٪ من التولودين الأزرق في PBS (لمدة 4 دقائق).
8. اغسل الأقسام عدة مرات بالماء منزوع الأيونات. افحص الأقسام الملطخة تحت المجهر الضوئي باستخدام أهداف 4x (NA 0.1 ∞ / -) و 10x (NA of 0.22 ∞ / 0.17) و 40x (NA of 0.65 ∞ / 0.17) و 100x (NA of 1.25 ∞ / 0.17).
9. اجمع الأقسام فائقة النحافة على شبكات النيكل. أخضع الشبكات إلى TEM عند 180 كيلو فولت وعند تكبير 3,200x و 6,000x و / أو 8,000x.
تحليل TEM
1. اختر المعلمات البنية التحتية ذات الأهمية لتحليل TEM الكمي (على سبيل المثال ، العروات ذات الحويصلات والميتوكوندريا أو المحاور النخاعية وغير الميالينية) والتقط صور TEM لهذه المعلمات تحت تكبير 3,500x و 6,000x و / أو 8,000x.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 1045 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'> < col style = 'العرض: 17.13٪ ؛ '>< col style = 'width: 40.86٪ ؛ '>List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments المجهر الخفيف Basic DM ELeica < td style = 'width: 250pt ؛ '>-4x (NA 0.1 ∞/-) ، 10x (NA 0.A. 22 ∞ / 0.17) ، 40x (NA 0.65 ∞ / 0.17) ، 100x (NA 1.25 ∞ / 0.17) الأهداف< نمط TD = 'الارتفاع: 15.75 نقطة ؛ العرض: 189 نقطة ؛ '>ملقط مرقئ البعوض (12.5 سم ، منحني) < نمط td = 'العرض: 179pt ؛ '>FST 13010-12 < td style = 'العرض: 427pt ؛ '> شبكات النيكل ، 200 شبكة < td style = 'العرض: 179pt ؛ '> تيد بيلا1GC200 Razor bladesSchick87-10489 Technovit 4004 مكونان من الغراء Kulzer جهاز شفرة الحلاقة الاهتزازي الرقيق< نمط td = 'العرض: 179pt;'>Krup-with Szabo thin bladesToluidine blueSigma-Aldrich89640 Transmission Electronic Stereoscope C20Phillips-حتى 200 كيلو فولتUltracut EReichert-Jung-ultramicrotomeAralditeCIBA-GEIGY23857.9resin لتضمين الأنسجة< td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ '>الأوزميوم (الثامن) - الأكسدة Degussa 73219

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission