التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال للالتقام الخلوي المشبكي في الخلايا العصبية في الحصين الفأر

الملخص

المصدر: فياريال ، س. ، وآخرون. al. ، قياس الالتقام الخلوي الحويصلي المشبكي في الخلايا العصبية الحصين المستنبتة. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تحليل الالتقام الخلوي الحويصلي المشبكي في الخلايا العصبية في الحصين المستنبتة من خلال وضع العلامات على بيروكسيداز الفجل والفحص المجهري الإلكتروني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

المجهر الإلكتروني

1. {{}} تحضير محلول تحفيز مرتفع K⁺ مع HRP (بيروكسيداز الفجل الحار) مثل 31.5 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد الكالسيوم₂ ، 90 ملي مولار KCl ، 25 ملي مولار هيبس (درجة الحموضة 7.4) ، 30 ملي مولار جلوكوز ، 2 ملي مولار MgCl₂ ، 0.01 ملي مولار CNQX ، 0.05 ملي مولار AP5 ، و 5 مجم / مل HRP ، ثم اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.4 مع 5 M هيدروكسيد الصوديوم.
   1. تحفيز ثقافة الخلايا العصبية في الحصين بمحلول تحفيز K ⁺ مرتفع 1.5 مل في درجة حرارة الغرفة (يشار إليه باسم K ⁺ ) عن طريق إضافة 1.5 مل إلى كل بئر لمدة 90 ثانية. في حالة الراحة (يشار إليها باسم R) ، ضع نفس تركيز 5 مجم / مل HRP لمدة 90 ثانية ، ولكن مع محلول ملحي عادي. بالنسبة لعينة الاسترداد ، ضع محلول تحفيز K ⁺ عالي كما هو الحال مع عينة K ⁺ ، ثم اغسلها بسرعة واستبدلها بمحلول ملحي عادي واحتضنه لمدة 10 دقائق.
2. التثبيت والتلوين
   
   1. قم بإعداد 0.1 M Na cacodylate المؤقت باستخدام 21.4 جم / لتر Na cacodylate عند درجة الحموضة 7.4. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ جلوتارالديهايد في 0.1 M Na cacodylate buffer لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. يغسل ثلاث مرات باستخدام عازلة كاكوديلات 0.1 M Na لمدة 7 دقائق لكل منهما.
   2. قم بإعداد محلول ديامينوبنزيدين (DAB) ، الذي يتكون من 0.5 مجم / مل من DAB مع 0.3٪ H₂O ₂ في ddH₂O ، والتصفية بمرشح 0.22 ميكرومتر. ضع محلول DAB سعة 1.5 مل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اغسل ثلاث مرات باستخدام عازلة cacodylate 0.1 M Na لمدة 7 دقائق لكل منها.
      تنبيه: DAB مادة مسرطنة سامة ومشتبه بها. يرجى استخدام القفازات ومعاطف المختبر.
      ملاحظة: يحدث وضع العلامات باستخدام DAB بسبب أكسدته بواسطة H₂O ₂ ، كما تم تحفيزه بواسطة HRP. تؤدي الزيادات الطفيفة في المكونات إلى زيادة الإشارة في العينة. تؤدي زيادة تركيز HRP إلى تسريع تأثير المحفز. تسمح التركيزات الكبيرة بما فيه الكفاية من H₂O ₂ بتفاعلات جانبية منهكة باستخدام HRP ، مما يثبط تأثير وضع العلامات ³² . في هذا العمل ، تم اختيار تركيزات نظام الوسم هذا بناء على الأبحاث المتاحة حاليا.
   3. احتضان الخلايا العصبية ب 1.5 مل من 1٪ OsO ₄ في 0.1 M Na cacodylate buffer لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية كتثبيت لاحق. يغسل ثلاث مرات ب 1.5 مل من 0.1 M Na cacodylate المؤقت لمدة 7 دقائق لكل منهما.
      تنبيه: نظرا لسمية وتفاعل OsO ₄ ، فإن الاحتفاظ بالعينة على الجليد في غطاء كيماوي يفضل في كثير من الحالات على استخدام الثلاجة للحضانة.
   4. قم بإعداد 0.1 M من أسيتات الصوديوم مع 13.61 جم / لتر من أسيتات الصوديوم و 11.43 مل / لتر من حمض الخليك الجليدي عند درجة الحموضة 5.0. يغسل ثلاث مرات باستخدام 1.5 مل 0.1 م أسيتات احتياطي عند درجة الحموضة 5.0 لمدة 7 دقائق لكل منهما واحتضانه ب 1.5 مل أسيتات اليورانيل 1٪ في محلول أسيتات 0.1 متر عند درجة الحموضة 5.0 لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. يغسل ثلاث مرات بمحلول أسيتات 1.5 مل 0.1 م لمدة 7 دقائق لكل منهما.
      
3. تضمين الايبوكسي
   
   1. } تجفيف مزرعة الخلايا العصبية بغسلات واحدة سعة 1.5 مل بنسبة 50٪ و 70٪ و 90٪ إيثانول لمدة 7 دقائق في كل منها ثم 3 غسلات من 1.5 مل 100٪ إيثانول لمدة 7 دقائق لكل منها في غطاء الدخان.
   2. امزج 485 مل / لتر من راتنجات الايبوكسي بيسفينول أ (إيبيكلورهيدرين) ، و 160 مل / لتر أنهيدريد دوديسينيل سكسينيك (DDSA) ، و 340 مل / لتر من ميثيل -5-نوربورنين -2،3-ثنائي الكربوكسيل أنهيدريد (NMA) ، و 15 مل / لتر 2،4،6-تريس (ثنائي ميثيل أمينوميثيل) الفينول (DMP-30) لإنشاء راتنجات الايبوكسي. تخلط جيدا ، ثم تخزن تحت المكنسة الكهربائية لإزالة فقاعات الهواء.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان إزالة فقاعات الهواء في الراتنج ، خاصة تلك الأصغر من المرئية للعين المجردة ، لأنها يمكن أن تسبب تساويف في الراتنج أثناء التقسيم.
   3. تسلل العينة عن طريق استبدال الإيثانول براتنجات الايبوكسي بنسبة 50٪ في الإيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر ، ثم 70٪ راتنجات الايبوكسي في الإيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
   4. قم بتبديل محلول راتنجات الايبوكسي براتنجات الايبوكسي بنسبة 100٪ واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية. قم بإجراء تبادلين لراتنجات الايبوكسي الطازجة بنسبة 100٪ مع حضانات لمدة ساعة واحدة عند 50 درجة مئوية. أضف راتنجات الايبوكسي الطازجة بنسبة 100٪ واتركها تتماسك عند 50 درجة مئوية طوال الليل ثم عند 60 درجة مئوية لأكثر من 36 ساعة لتتجمد.
4. قم بإزالة كل عينة من لوحة بئر المعطي بمنشار يدوي لصائغ. حدد مناطق الاهتمام ، وتركيزات كثيفة من الخلايا ، باستخدام مجهر ضوئي مقلوب ، ثم قم بقص كتل من 70 إلى 80 نانومتر للتقسيم بواسطة الميكروتوم. قم بتركيب المنطقة المقطوعة في ظرف الميكروتوم وقم بتحميل الميكروتوم. ضع الظرف في الميكروتوم وقم بتركيب سكين ماسي مع الحافة الموازية لسطح الكتلة. اجمع الأقسام بسماكة 70 إلى 80 نانومتر مباشرة على الشبكات الفردية.
5. قم بإذابة أسيتات اليورانيل في الماء للحصول على محلول بنسبة 1٪ من حيث الوزن ، ثم قم بإذابة سترات الرصاص بشكل منفصل في الماء للحصول على محلول 3٪ بالوزن. قم بتلطيخ الأقسام عن طريق الغمر بخلات اليورانيل المائية بنسبة 1٪ لمدة 15 دقيقة ثم 3٪ سترات الرصاص المائية لمدة 5 دقائق لتحسين تباين العينات.
6. التصوير الكهرومغناطيسي
   1. افحص الأقسام بمجهر إلكتروني ناقل وسجل الصور باستخدام كاميرا رقمية CCD بتكبير أولي يتراوح بين 10,000 و 20,000 ضعف.

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول: = 'العرض: 651 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> < col style = 'العرض: 15.21٪ ؛ '>< col style = 'width: 17.05٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'border-top-style: none ؛ height: 14.5pt ؛ width: 99pt ؛ '> Neurobasal medium < td style = 'border-left-style: none ؛ border-top-style: none ؛ width: 111pt ؛ '> thermo Fisher21103-049 Growth for neuron, Warmup to 37 °C قبل الاستخدامB27Thermo Fisher17504-044Gradient للتمايز العصبيGlutamaxThermo Fisher35050-061Gradient for neuronal cultureTrypsin XI from pancrease البقريSigmaT1005Neuronal culture-digest hippocampal tissuesDeoxyribonuclease I from bovine pancreas< td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:111pt;'>SigmaD5025Neuronal culture-inhibits scogus cell suspensionPoly-l-lysineSigmaP4832 < td style = 'border-left-style: none ؛ border-top-style: none ؛ width: 295pt ؛ '> المجهر الإلكتروني ، الركيزة لنمو الخلايا العصبية ، يوضع على لوحة متعددة الآبار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل بالماء المعقم 3 مرات < td style = 'border-top-style: none ؛ height: 58.0pt ؛ width: 99pt ؛ '> Horseradish peroxidase (HRP) < td style = 'border-left-style: none ؛ border-top-style: none ؛ width: 111pt ؛ '>SigmaP6782 المجهر الإلكتروني ، وضع العلامات على الحويصلات المشبكية الداخلية عن طريق تحفيز DAB في وجود بيروكسيد الهيدروجين ، التركيز النهائي هو 5 مجم / مل في محلول ملحي عادي ، اجعله طازجا قبل الاستخدام< td style = 'border-top-style: none؛ height: 29.0pt؛ width: 99pt ؛ '> cacodylate الصوديومElectron Microscopy Sciences12300 المجهر الإلكتروني ، مخزن مؤقت للمثبتات والغسيل ، التركيز النهائي هو 0.1 N<td style = 'border-top-style: none؛ height: 43.5pt; width: 99pt;'>3،3′-Diaminobenzidine(DAB)SigmaD8001 المجهر الإلكتروني ، وضع العلامات على الحويصلات المشبكية الداخلية ، الركيزة ل HRP ، التركيز النهائي 0.5 مجم / مل في DDW وتصفيته ، اجعله طازجا قبل الاستخدامالهيدروجين محلول بيروكسيد< نمط TD = 'نمط اليسار الحدود: لا شيء ؛ نمط الحدود العلوي: لا شيء ؛ العرض: 111pt ؛ '> Sigma < نمط td = 'نمط اليسار الحدود: لا شيء ؛ نمط الحدود العلوي: لا شيء ؛ العرض: 146pt ؛ '>H1009 < td style = 'نمط اليسار الحدود: لا شيء ؛ نمط الحدود العلوي: لا شيء ؛ العرض : 295pt ؛ '> المجهر الإلكتروني ، وضع العلامات على الحويصلات المشبكية الداخلية عن طريق إحداث تفاعل HRP-DAB ، التركيز النهائي 0.3٪ في DDW ، اجعله طازجا قبل الاستخدامGlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16365المجهر الإلكتروني ، المثبتات ، التركيز النهائي 4٪ في المخزن المؤقت Na-cacodylate ، اجعلها طازجة قبل الاستخدام ، رجها جيدا قبل الاستخدامTEMJEOL200CX المجهر الإلكتروني وتصوير الحويصلات الخلوية وتغيرات البنية التحتيةCCD digital cameraAMTXR-100Electron المجهري، التقاط الصورLead citrateLeica microsystems16707235المجهر الإلكتروني ، تلطيخ الشبكة