تصوير التلألؤ البيولوجي للالتهاب العصبي في الفأر المعدل وراثيا

الملخص

المصدر: Breid, S., et . al. تصوير التلألؤ البيولوجي للالتهاب العصبي في الفئران المعدلة وراثيا بعد التلقيح المحيطي لألياف ألفا سينوكلين. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو التصوير الحيوي للالتهاب العصبي في الفئران المعدلة وراثيا ، ويعرض تفاعلات لوسيفيراز لوسيفيرين في الخلايا النجمية المنشطة. يتيح البروتوكول القياس الكمي غير الجراحي للتنشيط النجمي ، مما يساعد في الدراسات حول التهاب الجهاز العصبي المركزي والفعالية العلاجية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

نموذج

1. Intercross hemizygous Tg(Gfap-luc+/-) الفئران مع الفئران Tg (M83+/-) لتوليد فئران نصف الجوثة ثنائية الأصل Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-).
2. قم بكتابة النسل الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لوجود الجينات المعدلة وراثيا التي تشفر ألفا سينوكلين البشرية ومع تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي للوسيفيراز اليراع.
3. تلقيح في سن ستة إلى ثمانية أسابيع.

تحضير اللقاح

1. تحضير ألفا سينوكلين بشري مؤتلف أحادي مع طفرة A53T في محلول ملحي مخزن تریس (TBS) يحتوي على 150 ملي كلوريد الصوديوم في 20 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.2).
2. قم بإعداد ألفا سينوكلين الليفي للتلقيح عن طريق تحريك 3 ميكروغرام / ميكرولتر من ألفا سينوكلين البشري المؤتلف الأحادي في شاكر مداري عند 800 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
3. تمييع مجموعات الألياف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / ميكرولتر للتلقيح داخل الصفاق.
4. قم بتجزئة ألياف ألفا سينوكلين باستخدام قضيب صوتي لمدة 1 دقيقة (40 نبضة مدتها 0.5 ثانية مع توقف لمدة ثانية واحدة بين كل نبضة وضبط السعة على 50٪) على الجليد. لتجنب التلوث عن طريق البذر المتقاطع. استخدم مجسات صوتنة نظيفة لإعداد لقاح مختلف.

الحقن داخل الصفاق

1. للحقن داخل الصفاق ، قم بتخدير قريبا في غرفة التخدير عن طريق الاستنشاق بالأيزوفلوران / الأكسجين باستخدام معدل تدفق 2 لتر / دقيقة وضبط المرذاذ على 2٪. اضغط على إصبع قدم وتأكد من أنه لا يسحب طرفه الخلفي لضمان التخدير المناسب.
2. املأ حقنة تحت الجلد 27 جم يمكن التخلص منها ب 50 ميكرولتر من ألياف ألفا سينوكلين صوتية أو PBS.
3. حقن مباشرة في الصفاق من الفأر وتجنب اختراق الأمعاء الدقيقة أو الأعور الموجودة خلف جدار البطن عن طريق إمساك في وضع ظهري مع توجيه الرأس بعيدا عن المحقق وإلى أسفل عند حوالي 45 درجة. راقب حتى تتعافى من التخدير.

تصوير التلألؤ الحيوي

1. الصورة Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) الفئران كل 2-4 أسابيع باستخدام نظام تصوير التلألؤ الحيوي.
2. قبل التصوير قريبا ، قم بتخدير الفئران في غرفة الأيزوفلوران / الأكسجين بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة وضبط المرذاذ على 2٪. اضغط على إصبع قدم وتأكد من أنه لا يسحب طرفه الخلفي لضمان التخدير المناسب.
3. احلق وقم بإزالة رؤوس الفئران بكريم مزيل للشعر. قم بتلوين الأذنين باللون الأسود بعلامة غير مزعجة لمنع التلألؤ البيولوجي غير المحدد.
4. تمييع ملح البوتاسيوم D-luciferin ، ركيزة لوسيفيراز ، في PBS إلى محلول مخزون 30 مجم / مل. قم بتخزينه في 1 مل من الكميات عند -20 درجة مئوية. احم D-luciferin المذاب من التعرض للضوء.
5. قم بوزن قبل الحقن. احسب الحجم الدقيق ل D-luciferin لحقن 150 مجم / كجم من وزن الجسم. حقن D-luciferin داخل الصفاق وإعادة إلى غرفة التخدير.
6. ابدأ تشغيل برنامج التصوير. بعد أن يصل نظام التصوير إلى درجة حرارة التشغيل الخاصة به ، قم بتهيئة النظام بالنقر فوق الزر "تهيئة" في لوحة التحكم.
7. حدد الزرين "Luminescent" و "Photograph". اضبط وقت التعريض الضوئي على 60 ثانية، والتجميع على "متوسط"، وF/Stop على "1"، وكسب EM على "إيقاف".
8. تأكد من ضبط مرشح الإثارة على "حظر" ومرشح الانبعاث على "فتح" ، واضبط ارتفاع الموضوع على 1.50 سم.
9. بعد عشر دقائق من الحقن باستخدام D-luciferin ، ضع على لوحة التسخين في غرفة التصوير وتأكد من وضع كماماتها بشكل صحيح في مخرج التخدير. أغلق تدفق الأيزوفلوران / الأكسجين من غرفة الاستنشاق وافتح التدفق لغرفة التصوير بمعدل تدفق 0.25 لتر / دقيقة وتبخر 2٪. أغلق باب غرفة التصوير بشكل صحيح.
10. انقر فوق الزر "اكتساب" لقياس التلألؤ البيولوجي ، والذي يستغرق 60 ثانية.

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "العرض: 534pt;'>< td style='العرض:135pt;'> الأسهم< td style='العرض:135pt;'> < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 211pt ؛ '>Tg (M83 + / -) الفئران أو B6 ؛ C3-Tg (Prnp-SNCA * A53T) 83Vle / J الفئران < td النمط = 'العرض: 98pt ؛ '> مختبر جاكسون < td style = 'العرض: 90pt ؛ '> 4479 < td style = 'width: 135pt ؛ '>

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
27-gauge syringe	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN 4831850
depilatory cream	Veet
Secureline lab lab marker	Neolab	25040
D-luciferin ملح البوتاسيوم	Acris	LK10000	30 ملغ / مل محلول
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer