وضع العلامات الرجعية للخلايا العصبية الحركية ذبابة الفاكهة باستخدام الأصباغ الفلورية المحبة للدهون

الملخص

المصدر: Inal, M. A. et. al., التتبع الرجعي ل ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الحركية الجنينية باستخدام الأصباغ الفلورية المحبة للدهون. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو طريقة وضع العلامات الرجعية ل ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الحركية باستخدام الأصباغ المحبة للدهون. تدخل الصبغة إلى المحور العصبي ، وتنتقل إلى الوراء ، وتصنف الخلايا العصبية باللون الأخضر ، مما يسمح بتصور مفصل لمورفولوجيتها وإسقاطاتها تحت مجهر متحد البؤر.

البروتوكول

1. المعدات واللوازم

1. {{}} مواد لجمع الأجنة وتدريب البالغين على وضع البيض
   1. قم بإعداد جهاز الترشيح عن طريق قطع أنبوب سعة 50 مل وفتح ثقب في الغطاء لوضع مرشح شبكي بمسام 100 ميكرومتر (جدول المواد) بين الأنبوب و الغطاء.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مصافي الخلايا ذات المسام 100 ميكرومتر (جدول المواد ) لخطوة الترشيح لجمع الأجنة.
   2. اصنع أطباق أجار من خلطة أجار العنب (جدول المواد ) وفقا للتعليمات المدرجة. باختصار ، حرك كيس واحد من مزيج المسحوق برفق في 500 مل من درجة حرارة الغرفة (RT ، 23 درجة مئوية) من الماء المقطر (dH ₂ O) وقم بتسخين الخليط المذاب في الميكروويف حتى يغلي بقوة. بعد التبريد إلى 70-75 درجة مئوية ، اسكب الخليط في أطباق بتري (60 مم). بعد أن يتم تصلب الأجار ، قم بتخزين الأطباق في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   3. قم بإعداد معجون الخميرة عن طريق خلط الخميرة الجافة النشطة (جدول المواد ) والماء حتى يصبح قوام العجين ، واحتفظ به عند 4 درجات مئوية.
   4. استخدم أقفاص جمع البيض (لطبق بتري 60 مم ، جدول المواد) التي توفر تدفقا كافيا للهواء.
      
2. تحضير إبر التشريح والماصات الدقيقة لحقن الأصباغ
   1. إعداد ماصة دقيقة لحقن الصبغة وإبرة تشريح من نفس الأنبوب الشعري بقطر داخلي يبلغ 0.6 مم وقطر خارجي 1.2 مم (جدول المواد). اسحب الأنبوب الشعري بواسطة مجتذب ماصة دقيقة بنسبة 7٪ من أقصى إخراج 170 فولت (جدول المواد) لإنشاء إبرة حادة بطول مستدق يبلغ ~0.4 سم.
   2. لحقن الصبغة، اضبط الماصة الدقيقة باستخدام ماصة دقيقة مشطوفة (جدول المواد) بواسطة تقنية شطف الفقاعات الموضحة في دليل الأداة.
      1. باختصار ، انقع المطحنة بعامل ترطيب ( جدول المواد ) لمنع الماء من "سحب" طرف الإبرة. ضع الإبرة على مشبك الماصة الدقيقة عند 25-30 درجة وقم بخفض الطرف على ثلثي نصف القطر من مركز سطح الشطف. قم بطحن الإبرة بينما تدفع المحقنة ذات الأنابيب الهواء إلى الإبرة للتأكد من أن الماصة الدقيقة ستكون خالية من نشارة الزجاج.
      2. ضع علامة على الماصة الدقيقة بعلامة دائمة ذات طرف رفيع للإشارة إلى موضع الفتحة عند الطرف بعد الشطف حيث يصعب تحديد موقع الفتحة الضيقة للماصة الدقيقة التي تتكون بزاوية.

2. التحضير لجمع الأجنة

1. تأكد من الحفاظ على الذباب البالغ (20-40 من النوع البري كانتون-إس أو ذباب أبيض) ، من الذكور والإناث ، في ظروف صغيرة (<7 أيام) وصحية لجمع البيض المثالي.
   ملاحظة: لتحفيز وضع البيض ، يتم تدريب الذباب في قفص جمع البيض قبل يومين من جمع البيض على أطباق أجار مخططة بمعجون الخميرة مرة واحدة على الأقل كل يوم.

3. التدريج للأجنة

1. اسمح للذباب بوضع البيض طوال الليل (أو 15 ساعة على الأقل) في RT لجمع الأجنة بعد 15 ساعة من وضع البيض (AEL) ، أي المرحلة 16 ، لعرض تكوين التغصنات لخلية الزاوية الأمامية (aCC) والخلايا العصبية الحركية للجمبري الخام 3 (RP3). في الصباح ، اجمع الطبق مع البيض.
   ملاحظة: سيكون للأجنة عند 15 ساعة AEL أمعاء مميزة من 4 غرف. للتصوير ، اتبع المراحل المختلفة معاييرها المورفولوجية المحددة وظروف الشيخوخة.
2. لجمع الأجنة ، قم بإزالة البويضات الموضوعة على الطبق باستخدام مبيض بنسبة 50٪ لمدة 5 دقائق.
3. بمجرد تنظيف المشيمات ، اسكب محتويات اللوحة من خلال جهاز الترشيح أو مصفاة الخلية لعزل الأجنة. باستخدام زجاجة ماء مضغوطة ، قم بتخفيف المبيض المتبقي على الطبق واجمع أكبر عدد ممكن من الأجنة عن طريق صب الخليط في الفلتر.
4. اغسل الأجنة على الفلتر 3-4 مرات بمزيد من الماء أو حتى تتبدد رائحة التبييض. قم بإزالة الفلتر من الجهاز واغسل الأجنة على طبق نظيف آخر بالماء. صب الماء من الصفيحة الجديدة التي توجد عليها الأجنة.
5. قم بإعداد شريحة زجاجية عن طريق تغطيتها بطبقتين من شريط الفينيل في المنتصف ، لتشكيل مستطيل. قطع بركة مستطيلة من الشريط باستخدام شفرة حلاقة. ضع شريطا رفيعا من الشريط اللاصق على الوجهين باتجاه الطرف العلوي من المسبح ، وهذا هو المكان الذي سيتم فيه وضع الأجنة كما هو موضح في الشكل 1 .
6. باستخدام ملقط دقيق ، حدد بشكل فردي 5-10 أجنة عند 15 ساعة AEL وضعها على الشريط على الوجهين بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى. أضف محلول ملحي للحشرة رينجر إلى حوض التشريح لحماية الأجنة من الجفاف ( الشكل 1 ).

4. التشريح والتلطيخ

1. باستخدام إبرة زجاجية تحت مجهر تشريح (جدول المواد) ، قطع خط الوسط لجنين واحد على سطحه من نهايته الخلفية إلى نهايته الأمامية. ثم اسحب الجنين للخارج من غشاء vitelline من الشريط على الزجاج (محاصر في الشكل 1 ). احرص على عدم إتلاف الأنسجة الداخلية للجنين.
2. اقلب الأنسجة الظهارية من المركز وقم بتوصيل حافة البشرة على سطح الشريحة الزجاجية ( الشكل 1 ، داخلي).
3. باستخدام إبرة متصلة بالأنبوب بفتحة طرف ~ 300 ميكرومتر (محضرة عن طريق كسر الطرف الرفيع لإبرة التشريح) ، قم بشفط الهواء أو نفخه لفصل وإزالة جذوع القصبة الهوائية الطولية الظهرية بالإضافة إلى أي أحشاء متبقية.
4. استخدم 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإصلاح الأجنة لمدة 5 دقائق في RT. اغسل الأجنة 3 مرات باستخدام PBS.
5. تلطيخ الأجنة ب 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للبيروكسيداز المضاد للفجل المقترن بصبغة السيانين 3 (مضاد ل HRP Cy3) ( جدول المواد ) في 200 ميكرولتر من PBS لمدة 1 ساعة. اغسل الأجنة باستخدام PBS 3x بعد تلطيخها.
   ملاحظة: يمكن تغيير صبغة مكافحة HRP بناء على الأصباغ المحبة للدهون المفضلة للحقن.

5. حشوة ماصة الحقن الدقيقة

1. الأصباغ المحبة للدهون الحرارية (5 مجم / مل من 3،3'-ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانين ، بيركلورات (DiO) أو 1،1′-ديوكتاديسيل-3،3،3′ - رباعي ميثيل إندوديكاربوسيانين ، 4-ملح كلوروبنزين سلفونات (DiD) ، جدول المواد ) إلى 60 درجة مئوية في خليط 1:10 من الإيثانول: الزيت النباتي قبل الاستخدام.
2. قم بإعداد شريحة صبغة مذابة بالزيت لماصة الحقن الدقيقة. ضع الماصة الدقيقة في حامل الشعيرات الدموية ( الشكل 2 ، # 1). باستخدام أداة المعالجة الدقيقة (جدول المواد)، اضبط الماصة الدقيقة لتكون فوق شريحة الصبغة. بعد ذلك، اضبط المرحلة لوضع الماصة الدقيقة على الصبغة ( الشكل 2، #2).
3. لملء الماصة الدقيقة ، استخدم حاقن دقيق (جدول المواد ) ( الشكل 2 ، # 3). اجمع الصبغة في الماصة الدقيقة عن طريق ضبط P_i (ضغط الحقن) بين 200-500 hPa (hectopascal) ، و T _i (وقت الحقن) بين 0.1−0.5 ثانية و P _c (ضغط التعويض) إلى 0 hPa لمدة 5 دقائق ( الشكل 2 ، #4).
4. بمجرد جمع الصبغة ، قم بإزالة شريحة الصبغة وضع العينة على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، قم بزيادة الكمبيوتر إلى نطاق 20-60 هكتوباسكال قبل خفض الماصة الدقيقة في العينة لمنع تلوث PBS بعمل الشعيرات الدموية.

6. حقن الصبغة في الخلايا العصبية

1. حدد موقع الجنين في المركز باستخدام المجهر بعدسة موضوعية 10x (جدول المواد) وقم بمحاذاة الماصة الدقيقة مع الجنين.
   ملاحظة: يمكن ضبط حجم قطرة الصبغة عن طريق تغيير Pi أو حجم فتحة طرف الماصة الدقيقة. يجب أن تكون القطرة 10-20 ميكرومتر ، وهو ما يعادل عرض عضلة واحدة تقريبا.
2. قم بتغيير العدسة الموضوعية إلى عدسة غمر الماء 40x (جدول المواد) واغمر العدسة في PBS لرؤية الجنين.
   1. استخدم الفحص المجهري الفلوري للتحقق من مورفولوجيا الخلايا العصبية المميزة بمضاد HRP Cy3 وتحديد موقع الحقن.
   2. أثناء الحقن ، استخدم الفحص المجهري للحقل الساطع لرؤية قطرة الصبغة. عندما يكون الجنين في بؤرة التركيز ، قم بتغيير موضع الماصة الدقيقة لإجراء اتصال لطيف مع طرف المحور العصبي محل الاهتمام (على سبيل المثال ، aCC ، RP3).
   3. قم بإسقاط الصبغة في الجزء النصفي الأيمن للبطن (A2−A6) عند التقاطع العصبي العضلي ل aCC أو RP3 ( الشكل 3 ) إما مع DiD أو DiO ، باستخدام الخلايا العصبية المميزة بمضاد HRP Cy3. باستخدام التحكم اليدوي (الماوس ؛ الشكل 2 ، 5) حرر الصبغة وقم بإزالة الماصة الدقيقة بعد إسقاط الصبغة باستخدام المعالج الدقيق وانتقل إلى موقع الحقن التالي.
      ملاحظة: على عكس الأصباغ الأخرى (على سبيل المثال ، لوسيفر الأصفر والكالسين) التي تنتشر في الخلايا المجاورة من خلال تقاطعات الفجوة ، ترتبط الأصباغ المحبة للدهون بأغشية الخلايا ولا تنتقل إلى الجيران. نظرا للحجم الكبير نسبيا لقطرة الصبغة ، فإن هذه التقنية تؤدي أيضا إلى وضع العلامات على عضلات الشراكة ( الشكل 3 أ ).
3. احتضان العينة في RT لمدة 1 ساعة بعد إسقاط الصبغة قبل التصوير.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا قبل التركيب ، ويمكن الاحتفاظ بالعينة عند 4 درجات مئوية طوال الليل. يمكن أيضا توصيل الأصباغ المحبة للدهون باستخدام الرحلان الأيوني إذا كان مضخم الصوت المقترن المباشر داخل الخلايا (DC) متاحا بسهولة.

7. التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر

1. قم بإزالة الشريط على الوجهين وشريط الفينيل من الشريحة الزجاجية بمساعدة الملقط.
2. قم بإعداد زلة غطاء (22 × 22 مم 2 غطاء زجاجي رقم 1) بكمية صغيرة من الشحوم المفرغة ( جدول المواد ) في الزوايا الأربع وضعها بعناية على العينة ، وتجنب فقاعات الهواء. قم بإزالة أي PBS زائدة باستخدام مساحات المهام.
3. ادفع شريحة الغطاء لأسفل لضبط مسافة العمل بين العدسة الموضوعية والعينة. أغلق حواف الغطاء تماما بطلاء الأظافر.
4. صورة بتكبير 10x و 100x باستخدام مجهر متحد البؤر.

النتائج

الشكل 1: إعداد تجمع التشريح. تم إنشاء الغرفة الزرقاء التي تظهر على الشريحة الزجاجية بشريط فينيل يحافظ على المخازن المؤقتة بالداخل. يثبت الشريط على الوجهين الأجنة المحاذاة بشكل صحيح. يظهر أيضا في الزاوية اليسرى السفلية مثال على...

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = ';'>< col style = 'width: 25٪ ؛ '>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> 10x objective lens< td style = 'background-color: #ffffff ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> نيكون< td style='لون الخلفية:#ffffff;الحشوة:0 بكسل 3px;vertical-align:bottom;'> Plan40x water-immersion lensNikon< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>NIR ApoCapiley tubingFrederick Haer &<td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>27-31-1< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> المجهر متحد البؤرAndorN / ADragonfly Spinning disk confocal unitغطاء زجاجCorning نمط < td ='لون الخلفية:#ffffff;الحشو:0 بكسل 3 بكسل;المحاذاة الرأسية:أسفل;'>22x22 مم مربع #1DiD< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> ThermoFisher < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>V22886 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> نمط < td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأس#ffffff<>ية: ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> ThermoFisher< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>V22888 DiOThermoFisherV22887< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> تشريح المجهرNikonN / ASMZ-Uشريط مزدوج الوجه< نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة رأسية: أسفل ؛ '>سكوتش < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة رأسية: أسفل ؛ '> 665 < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> نمط < td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> داو كورنينج الشحوم عالية الفراغ< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Fisher Sci.< td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>14-635-5D Dumont #5 FallpsFine Science Tools< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 11252-20 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> قفص جمع البيض < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية#ffffff<>: ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية ؛ الأسفل ؛ >59-100< نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> FemtoJet 5247 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Eppendorf < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> توقف< td style='لون الخلفية:#ffffff;الحشو:0px 3px;vertical-align:bottom;'>FemtoJet 4i (رقم القط 5252000021)MicromanipulatorSutterMP-225 الماصة الدقيقة شطفاءSutter< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>BV-10-B< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>مجتذب الإبرة< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Narishige < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> PC-100 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Nutri-fly العنب أجار مسحوق بريمكسFlyStuff47-102 Nylon net filterMillipore paraformaldehyde 16٪ solution, EM gradeElectron Electron Microscopy Sciences< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 15710 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> أي درجات EM < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>PBS< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> روش < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>11666789001< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> يباع على sigmaaldrich ، محاصر 10x حل< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> الصورة فلو 200 < td النمط = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Kodak < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 146 4510 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحا#ffffff<>ذاة الرأسية: ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>مجهر مضان مستقيم < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة رأسية: أسفل ؛ '> نيكون < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> N / A < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Eclipse Ci مع مصدر ضوء LED < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> شريط كهربائي من الفينيلScotch6143 VWR Cell strainersVWR< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 10199-659 < نمط TD = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>الخميرة < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأس#ffffff<>ية: ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ '> 62-103< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة رأسية: أسفل ؛ '> الخميرة الجافة النشطة (RED STAR)