الفحص المجهري المناعي الفلوري للخلايا العصبية المتمايزة عن الخلايا المشتقة من الدم المحيطي

الملخص

المصدر: Becker-Kojić, Z. A., et . al. ، جيل خال من GM من الخلايا العصبية المشتقة من الدم. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح الفيديو بروتوكولا لإعداد الخلايا العصبية المشتقة من خلايا الدم المحيطية المعاد برمجتها للفحص المجهري الفلوري ، ويعرض أنواعا متميزة من الخلايا ومراحل النمو من خلال التصوير المناعي.

البروتوكول

1. تحليل المجهر المناعي للخلايا العصبية المشتقة من الدم
   1. زراعة الخلايا لمدة 16 يوما وإزالة الوسائط.
      1. احتضان بمثبت مسخن مسبقا يتكون من 75 مل من الماء المعقم ، 4 جم من بارافورمالدهايد. أضف 10 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة وحركه حتى ينضج المحلول. ثم أضف 10 مل من 10x PBS ، و 0.5 مل من MgCl ₂ ، و 2 مل من 0.5 M EGTA ، و 4 جم من السكروز. قم بالتحليل الحجمي إلى درجة الحموضة 7.4 مع 6 نيوتن حمض الهيدروكلوريك ، واحضر ما يصل إلى 100 مل من الماء المعقم لمدة 15 دقيقة.
      2. تخلص من المثبت واغسل الخلايا 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة. أضف على الفور محلول Triton X الطازج 0.3٪ وقم باختراق الخلايا لمدة 5 دقائق. اغسل 3 مرات باستخدام PBS وأضف محلول حجب مصنوع من PBS و 5٪ BSA.
      3. قم بسد الخلايا في درجة حرارة الغرفة على لوحة هزاز لمدة 1 ساعة.
      4. قم بإعداد التخفيفات المناسبة للأجسام المضادة في 1٪ BSA / PBS واحتضان الخلايا بتخفيفات الأجسام المضادة على صفيحة هزاز لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها ، واحتضن الخلايا باستخدام DAPI ، وقم بتركيب الغطاء بوسائط تثبيت للتصور على المجهر.
         ملاحظة: الأجسام المضادة المصنفة مباشرة المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في جدول المواد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
BSA Frac V 7.5٪	Gibco	15260037
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML