تحليل هياكل الأميلويد في قسم الأنسجة باستخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة الفلورية

الملخص

المصدر: Nyström، S.، وآخرون، تصوير أنسجة الأميلويد الملطخة بقليل الجوثيوفينات المترافقة المضيئة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر الفائق الطيفي والتصوير الفلوري مدى الحياة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو تحليل هياكل الأميلويد باستخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة الفلورية أو FLIM ، باستخدام صبغة hFTAA للكشف عن النوى المدمجة مثل الأزرق / الأخضر والمحيطات غير المستقرة مثل الأحمر / الأصفر في الصور المشفرة بالألوان ، مما يعكس تنظيم الأميلويد.

البروتوكول

1. تحضير عينات الأنسجة

ملاحظة: يمكن تصوير العديد من أنواع الأنسجة باستخدام حمض خليك ثيوفين ثيوفين (hFTAA) كعلامة أميلويد. hFTAA حساس للتشكل الكلي. وبالتالي يفضل إجراء التلوين على مجاميع غير متقطع مع عدم التعرض للحاتمة. يتم تحقيق الجودة الطيفية المثلى إذا تم الحفاظ على تثبيت الأنسجة إلى الحد الأدنى. ومن ثم ، يفضل استخدام المواد المجمدة الطازجة ، المثبتة برفق في الإيثانول في وقت التلوين. ومع ذلك ، من الممكن اكتشاف رواسب الأميلويد أيضا في الأنسجة التي تم إصلاحها باستخدام ، على سبيل المثال ، الفورمالين. يخترق hFTAA الأنسجة بشكل جيد. حدد سماكة العينة المتوافقة مع تقنية التصوير المقصودة.

1. إذا تم استخدام أقسام مثبتة بالفورمالين ومدمجة في البارافين ، فيجب إزالة البارافين في الزيلين طوال الليل. بعد ذلك ، اغمس الأقسام في حمامات متتالية من 99٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، dH ₂ O ، ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 10 دقائق في كل منهما. اترك أقسام الأنسجة تجف في ظل الظروف المحيطة.
   تحذير: يتم التعامل مع الزيلين دائما في غطاء دخان كيميائي. الزيلين والمذيبات العضوية الأخرى ضارة.
   1. قم بإذابة المقاطع البردية في درجة حرارة الغرفة. قم بإصلاح أقسام الأنسجة في 10٪ فورمالين طوال الليل وأعد ترطيبها عن طريق غمسها في حمامات متتالية من 99٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، dH ₂ O ، و PBS ، 10 دقائق في كل منهما. اترك أقسام الأنسجة تجف في ظل الظروف المحيطة.
2. أضف قطرات من محلول عمل hFTAA (حوالي 200 ميكرولتر) إلى أقسام الأنسجة لتغطيتها. يجب أن تبقى القطرة في مكانها بسبب التوتر السطحي. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتلطيخ.
3. اشطف محلول التلوين ب 500 ميكرولتر PBS باستخدام ماصة ثم اغمر الشريحة في حمام PBS لمدة 10 دقائق. اترك القسم يجف في ظل الظروف المحيطة.
4. قم بالتركيب باستخدام وسط تركيب الفلورة. اترك وسط التركيب يستقر طوال الليل.

2. FLIM
} ملاحظة: تم تجهيز المجهر متحد البؤر بوحدة مجهر تصوير مدى الحياة الفلورية (FLIM).

1. قم بإعداد المعلمات التالية للمجهر متحد البؤر: الثقب ، 20 ؛ الطول الموجي للإثارة ، 490 نانومتر ؛ شدة الليزر ، 0.5٪ (ما يعادل متوسط طاقة 7.5 ميكروواط). استخدم أشعة الليزر النبضية بسرعة 40 ميجاهرتز.

2. في برنامج FLIM ، قم بإعداد عد الفوتون الذي يزيد عن 550 نانومتر. في نافذة عرض المعلمات ، اتبع عد الفوتون حتى يصل الحد الأقصى للعدد إلى حوالي 4,000 عدد فوتونات.

3. احفظ الملف وقم بتصديره كصورة عد فوتون واحد (SPC).

4. قم بتركيب البيانات مع الاضمحلال الأسي المكون من 2 مكون في برنامج FLIM. الملاءمة التي تعطي χ² < 2 جيدة. القيمة الموجودة على المحور y هي عدد التهم لعمر معين.

5. حدد حدا لتضمين الأعداد ، على سبيل المثال ، 100. رمز اللون بواسطة T1 وحدد نطاق العمر. يعتمد الاضمحلال على بنية الأميلويد حيث يرتبط hFTAA. لوحظ عمر مضان يتراوح بين 300 و 1,000 نص. احفظ الملف.

6. قم بتصدير البيانات الأولية باستخدام خيارات التصدير واحفظ البيانات المطلوبة في مجلد جديد.

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "العرض: 700pt;'> < نمط TD = 'العرض: 117pt;'>Agilent Technologiestd style='height:14.5pt;width:285pt;'>LeicaDM6000< td style='الارتفاع:14.5pt;العرض:285pt;'>LSM780

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako وسيط تركيب الفلورسين	GM304	<
Leica
Lumen 200	Before
Spectraview system	ASI specttral imaging
Spectraview software	ASI specttral imaging
Zeiss
Zen 2010b v6.0 software	Zeiss
FLIM system	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Table Laser In Tune	Zeiss