مقالة منهجية

تصوير تهريب بروتين GLUT4 في الخلايا العصبية الأولية للفئران باستخدام الفحص المجهري لإزالة الالتواء

أبريل 28, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Changou, C. A., et. al. صور حية لبروتين GLUT4 الذي يبشر في الخلايا العصبية تحت المهاد الأولية للفأر باستخدام الفحص المجهري لإزالة الالتفاف. J. Vis. Exp. (2017).

يعرض هذا الفيديو تصوير نقل GLUT4 الناجم عن الأنسولين في الخلايا العصبية تحت المهاد ، باستخدام الفحص المجهري لإزالة الالتفاف لالتقاط وتحليل ديناميكيات تهريب GFP-GLUT4 بدقة عالية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.Live تسجيل الصور

  1. {{}} إعداد الخلايا للتصوير الحي

1. ثقافة WT و CCR5 - / - خلايا الخلايا العصبية تحت المهاد التي تعبر عن بروتين مضان أخضر يسمى ناقل الجلوكوز 4 (GFP-GLUT4) على الغطاء الزجاجي # 1.5 (أو سمك 0.17 مم) الذي تم طلاؤه مسبقا ب poly-D-Lysine في اللوحة المكونة من 6 آبار.

2. قم بإزالة الغطاء بعناية باستخدام الخلايا العصبية باستخدام الملقط ووضعه على الشرائح الزجاجية بحذر.

3. قم بإزالة الوسيط / السائل الزائد باستخدام مناديل مهمة دقيقة. قم بطي المناديل مرتين ، وضعها بحذر فوق الغطاء. اضغط برفق على المناديل المبللة دون تحريك الغطاء.
تنبيه: لا تضغط على الغطاء على الشريحة الزجاجية بقوة. الغرض من هذه الخطوة هو التأكد من أن الغطاء لا يتحرك / ينجرف أثناء الحصول على الصورة الناجمة عن قوة الطفو.

4. ضع أغطية وشرائح على مرحلة مجهر الالتفاف ، بحيث يكون الغطاء متجها لأسفل ، ومؤمنا بشكل صحيح. هذه الخطوة هي التأكد من أن موضع الشريحة يظل ثابتا حتى يتمكن المستخدمون من تتبع نفس مجموعة الخلايا المستهدفة لاحقا.

5. راقب خلايا الخلايا العصبية تحت المهاد WT و CCR5 - / - باستخدام عدسة موضوعية غمر زيت 60x / 1.42 NA.

6. عالج عينات الخلايا المختارة ب CCL5 (10 نانوغرام / مل) أو الأنسولين (10 وحدة / مل) لمدة دقيقة واحدة. أضف 1.5 ميكرولتر من الأنسولين المخفف على حافة الغطاء.

7. تصور وتسجيل عينات الخلايا المحددة على الفور. قم ببرمجة برنامج تسجيل الفيديو للتسجيل لمدة 30 دقيقة.

2. المجهر والتحليل بإزالة الالتواءات
} ملاحظة: يتطلب هذا الجزء من البروتوكول استخدام مجهر إزالة الالتواء وبرامج متخصصة للتحليل.

1. قم بتشغيل قوة نظام التصوير ، واسمح لمرحلة المجهر بالتهيئة بشكل صحيح ، ثم قم بتشغيل مصدر ضوء LED.

2. أضف زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520 للعينات الحية عند 37 درجة مئوية) على عدسة موضوعية 60 × 1.42 NA. ضع شريحة العينة على المجهر بحيث يكون الغطاء متجها نحو العدسة الموضوعية وقم بتأمين الشريحة بشكل صحيح.

3. استخدم إضاءة المجال الساطع أو الإضاءة الفلورية لتحديد الخلايا المستهدفة. اضبط التركيز البؤري حتى يمكن ملاحظة الخلايا المستهدفة بوضوح. لا تحرك العدسة الموضوعية خارج منطقة انزلاق الغطاء لتجنب علامات الخدش غير الضرورية.

4. تحديد ناقل الجلوكوز المترافق بالبروتين الفلوري الأخضر 4 (GFP-GLUT4) بواسطة إشارة GFP. تحديد الخلايا المستهدفة المطلوبة للحصول على الصور. يمكن حفظ موضع الخلية المستهدفة المحدد للرجوع إليه في المستقبل (انظر الشكل 1 ).

5. قم بإعداد المعلمات التجريبية المناسبة (بما في ذلك رقم البكسل ، والطول الموجي للإثارة ، ونسبة الإرسال ، ووقت التعرض ، وسمك المكدس ، والفاصل الزمني ، وإجمالي وقت التصوير) على كل خلية مستهدفة. في هذه التجربة ، تم تعيين رقم بكسل الصورة على 512 × 512 (يمكن ضبطه على 1,024 × 1,024 للحصول على دقة أعلى) لإشارات GFP. تم ضبط وقت التعريض الضوئي بين 0.025 إلى 0.05 ثانية لكل 5 دقائق. يمكن التحكم في التعديلات الجانبية الطفيفة x و y و z بواسطة البرنامج الموصى به (انظر جدول المواد).

6. اضبط معلمة التعريض الضوئي على ما يقرب من 2,000 إلى 3,000 عدد لتحقيق أقصى كثافة بكسل. لتقليل التبييض الضوئي الفلوري ، قلل من النسبة المئوية لانتقال ضوء الإثارة قدر الإمكان مع الحفاظ على وقت التعرض أقل من 1 ثانية. كرر هذه الخطوات لكل قناة (قناة) مضان إضافية وكل مجال اهتمام فردي.

7. قم بتعيين الحد الأعلى والأدنى للمكدس Z على كل خلية مستهدفة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تحريك مرحلة المجهر حتى يصبح الجزء العلوي والسفلي من الخلية المستهدفة خارج نطاق التركيز قليلا. يمكن للمستخدمين ضبط دقة المحور Z عن طريق ضبط عدد الصور بين الحد الأعلى والأدنى (والذي يمكن القيام به عن طريق تحديد المسافة بين كل صورة).

8. تم فك أكوام الصور وتحليلها لاحقا بمساعدة البرنامج المعني - Velocity من PerkinElmer في هذه الحالة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1

الشكل 1: لقطات GFP-GLUT4 في الخلايا العصبية تحت المهاد. (أ ، ج) بروتين GFP-GLUT4 معبر عنه في الخلايا العصبية تحت المهاد Wildtype (WT) و (B) CCR5- / - الخلايا العصبية تحت المهاد. تم تحفيز الخلايا العصبية بالأنسولين (أ ، ب) أو CCL5 (C). تشير الأسهم إلى ثقب GFP-GLUT4 في التهاب الأعصاب قبل (-) وبعد (+) الأنسولين أو تحفيز ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>DeltaVision deconvolution microscope < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>Applied Precision Inc. / (GE Healthcare Life Science) < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style='الحدود اليمنى: 1 بكسل شفافة صلبة؛ الحشو: 0 بكسل؛ المحاذاة الرأسية: أسفل؛'> مجهزة بعدسة موضوعية غمر بالزيت 60x / 1.42 NA ؛ تستخدم لالتقاط صور الخلايا الحيةSoftWorX application softwareApplied Precision Inc. used to control microscope and
cameraVoloCITY softwarePerkinElmer used to analysis imagesInsulinActrapid, Denmark<td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> KimwipesKimberly-Clark< td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>#FL42572A0.17mm thickness12 mm Microscope coverglassDeckglaser#41001112used for immmunstaining standard straight-head ملقطIdeal-tek Surgical toolCCL5/RANTES R&D Systems 10ng/ml5 مل ماصة Corning costar 4487 dissotivate tissue brain

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GLUT4 GFP GLUT4 CCR5 CCL5

مقالات ذات صلة