Method Article

التحليل المجهري للمشابك في شرائح الحصين الفأرية باستخدام التألق المناعي

April 28th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: McLeod, F., et al. تقييم كثافة المشبك في شرائح دماغ القوارض في الحصين. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصور العلامات المشبكية في شرائح دماغ الحصين باستخدام تحليل التألق المناعي متحد البؤر. يتم تلطيخ الشرائح بالمناعة بأجسام مضادة أولية تستهدف علامات ما قبل المشبكي وما بعد المشبكي ، تليها الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور. ثم يتم تصور العلامات المسماة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم البنية المشبكية من خلال توسيطها.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.

1. تحضير شريحة

  1. الحصين الحادة قم بإزالة دماغ الفأر في أسرع وقت ممكن باستخدام ملعقة ومقص حاد لقطع الجمجمة، ووضعها في الثلج البارد، المؤكسج (95٪ O2، 5٪ CO2)، السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي عالي السكروز (ACSF، ~ 100 مل).
  2. ضع دماغ الفأر على طبق بتري وقم بإزالة المخيخ وجزء صغير من القشرة الأمامية بمشرط قبل أن ينقسم إلى أسفل خط الوسط من الدماغ.
  3. ضع نصفي الكرة الأرضية على الجانب الذي تم قطعه للتو وقم بلصق كل نصف كرة على مسرح الاهتزاز.
  4. cut sections s-200-300 μm من منطقة الاهتمام الكاملة. في حالة الحصين ، يجب الحصول على ما يقرب من 3-4 شرائح لكل نصف كرة الأرضية.
  5. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية، انقل الشرائح إلى حجرة مغمورة بالأكسجين (95٪ O2, 5٪ CO2) ACSF. يحفظ عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    NOTE: في هذه المرحلة، يمكن معالجة الشرائح بعوامل دوائية نشطة، مثل بروتينات Dickkopf-1 المؤتلفة (Dkk1)، عن طريق إضافة العوامل إلى حجرة الشريحة.
  6. باستخدام فرشاة الرسم، قم بإزالة الشرائح من الحجرة، وضعها في طبق من 24 بئرا، وثبتها لمدة 20 دقيقة إلى 1 ساعة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA)/4٪ سكروز في درجة حرارة الغرفة (RT).
    Caution: PFA سام، ارتداء الحماية المناسبة.
  7. اغسل الشرائح ثلاث مرات في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X (PBS، 10 دقائق لكل منهما).
    NOTE: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة 1-2 أيام، طالما يتم الاحتفاظ بالشرائح عند 4 درجات مئوية في 1X PBS.

2. Immunofluorescence for Synaptic Markers

NOTE: يمكن العثور على وصفات جميع المخازن المؤقتة المستخدمة في الجدول 1.

في آبار الشرائح ، استبدل PBS بمخزن مؤقت للحجب / الاختراق (الجدول 1) واحتضانه في RT لمدة 4-6 ساعات.
  2. تمييع الجسم المضاد لخنزير غينيا متعدد النسيلة ضد ناقل الغلوتامات الحويصلي 1 (vGlut1) عند تخفيف 1: 2,000 في المخزن المؤقت للحجب / النفاذ.
    NOTE: vGlut1 هي علامة للتصور الطرفي الاستثاري قبل التشابك. لتحديد المشبك المثير بعد التشابك ، استخدم جسما مضادا متعدد النسيلة ضد كثافة ما بعد المشبكي -95 (PSD-95) وقم بتخفيف 1: 500 في نفس المحلول. استخدم حجم لا يقل عن 300 ميكرولتر في كل بئر. لتحديد الموقع التشريحي للحصين ، استخدم جسما مضادا يمكنه أيضا تحديد البنية العصبية ، مثل البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2) أو التوبولين. اعمل على التركيزات الصحيحة لجميع الأجسام المضادة الأولية للعلامات المشبكية المختارة (قبل وبعد التشابك المشبكي) وتخفيفها في المخزن المؤقت القابل للحجب / النفاذ.
  3. احتضان الشرائح في محلول الجسم المضاد الأساسي طوال الليل (أو لمدة 1-2 أيام) عند 4 درجات مئوية. استخدم منصة اهتزاز بحركة قوية.
  4. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS (10 دقائق لكل منها).
  5. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة 1:500 في المخزن المؤقت للحظر. على سبيل المثال ، عند استخدام الجسم المضاد vGlut1 لخنزير غينيا ، قم بتطبيق جسم مضاد ثانوي يتعرف على مكون خنزير غينيا (على سبيل المثال ، الحمار المضاد لخنزير غينيا) المقترن بفلوروفور معين. عند استخدام الجسم المضاد للأرانب PSD-95 ، قم بتطبيق جسم مضاد ثانوي يتعرف على مكون الأرانب (على سبيل المثال ، الحمار المضاد للأرانب) المقترن بفلوروفور محدد مختلف.
  6. احتضان الشرائح في هذا المحلول لمدة 2-3 ساعات في RT. تأكد من حماية الشرائح من الضوء، لأن الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء.
  7. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS (10 دقائق لكل منها).
  8. قم بإزالة الشرائح بعناية من اللوحة المكونة من 24 بئرا باستخدام فرشاة رسم وضعها بالتساوي على شرائح زجاجية مسبقة التصنيف. أضف قطرة من وسط التثبيت فوق كل شريحة ثم ضع غطاء زجاجيا برفق فوق الشرائح. تجنب تكوين فقاعات الهواء. احرص على استخدام وسيط تركيب كاف (300-400 ميكرولتر) ، لأن الكمية غير الكافية قد تؤدي إلى شرائح جافة.
  9. اتركيه ليجف لمدة لا تقل عن 1-2 أيام في RT واحتفظ بالشرائح محمية من الضوء.
  10. قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية على المدى القصير، ولكن للتخزين طويل الأجل، احتفظ بها عند -20 درجة مئوية.

3. الحصول على الصورة متحدة البؤر وتحليلها

  1. التصوير باستخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر.
    1. تحديد منطقة الحصين المراد تصويرها (على سبيل المثال، كورنو أمونيس 1 و 3 (CA1 ، CA3) أو التلفيف المسنن (DG)) عن طريق هدف 10x أو 20x.
    2. قم بالتغيير إلى هدف غمر الزيت 40x أو 63x للتأكد من أن تشريح الشريحة سليم من خلال تحديد الخلايا العصبية المستمرة والبنية المنظمة. استخدم علامة عصبية ، مثل MAP2 ، كمرجع (الشكل 1 أ).
    3. بعد ذلك، قم بالتبديل إلى هدف غمر الزيت بمعدل 60x (الفتحة العددية [NA] = ~ 1.3 - 1.4) واضبط الإعدادات لكل قناة للحصول على الإشارة والتباين الأمثل. استخدم خيار التباين العالي/المنخفض لضبط شدة كل ليزر لتجنب تشبع أي بكسل.
      NOTE: ستعتمد هذه الإعدادات على المجهر المستخدم، ولكن راجع جدول المواد لإعدادات طاقة الليزر. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم دقة 1024 × 1024 بكسل. يجب أن تظل الإعدادات ثابتة طوال الظروف المختلفة لنفس التجربة. يمكن تطبيق تكبير إضافي إذا لزم الأمر.
    4. قم بتقييم العمق حيث يكون التلوين متساويا واحصل على مجموعات صور لا تقل عن 8 مستويات متساوية البعد (250 نانومتر). ثم التقط 3 مجموعات صور تمثيلية متجاورة من نفس منطقة الاهتمام لكل شريحة.
      NOTE: قد يختلف العمق من شريحة إلى أخرى ولكن يجب أن يكون دائما حوالي 2-5 ميكرومتر من سطح الشريحة.
    5. كرر الاستحواذ في 3 شرائح على الأقل لكل حالة ومن 6-8 لكل مجموعة علاج.

الجدول 1: المخازن المؤقتة المستخدمة في تلطيخ الفلورسنت المناعي. <

فئة الشكل ='table' style='float:left;width:100٪;''>< td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>
Blocking/permeabilizing Buffer Concentration Notes
Donkey serum 10٪
Triton-X 0.50٪
PBS1x
10x PBS pH to 7.4
NaCl 1.37 M
KCl 27 mM
NaH2PO4 100 mM
KH2PO4 18 mM
4٪ PFA/4٪ Sucrose ph to 7.4
PBS 1x dildil from 10x
PFA 1.33 M
Sucrose 117 mM

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجدول 1: المخازن المؤقتة المستخدمة في تلطيخ الفلورسنت المناعي. <

فئة الشكل ='نمط الجدول' ='العرض:73.67٪;'><فئة الجدول ='ck-table-ressize'>Blocking/permeabilizing Buffer < td style='border-bottom-style: solid;border-color:black;border-left-style:none;border-right-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

<فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 750 نقطة ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>< col style = 'width: 19.73٪ ؛ '>List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments VibratomeLeicaVT1000S الجسم المضاد الأساسيMilliporeAB5905 vGlut1 (1: 2000)الجسم المضاد الأساسيThermo ScientificMA1-046 < td style = 'width: 300pt ؛ '>PSD-95 (1: 500) < td style = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ '> الأجسام المضادة الأوليةأنظمة synaptic131 004 < td style = 'width: 300pt ؛ '>vGAT (1: 500) < td style = 'height: 15.5pt ؛ '> PrimaryAntibody Synaptic Systems147011 Gephyrin (1: 500) < td style = 'height: 15.5pt ؛ '> Primary الأجسام المضادةAbcamab5392 < td style = 'width: 300pt ؛ '> MAP2 (1: 10000) < td style = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ '> الأجسام المضادة الثانويةمختبرات جاكسون706-545-148 < td style = 'width: 300pt ؛ '> donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1: 600) < td style = 'height: 15.5pt ؛ '> الأجسام المضادة الثانويةAbcamab175470 < td style = 'width: 300pt ؛ '> Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) تركيب متوسطSouthernBiotech00-4958-02 < td style = 'width: 300pt ؛ '>Fluoromount-G < td style = 'height: 62.0pt ؛ '> المجهر متحد البؤرOlympusNA < td style = 'width: 300pt ؛ '> FV1000 المجهر متحد البؤر باستخدام هدف زيت 60x 1.35 فتحة عددية (NA). بالنسبة إلى vGlut1 ، استخدم ليزر 488 بقوة مئوية تبلغ 14٪. بالنسبة ل PSD-95 ، استخدم ليزر 559 بنسبة مئوية تبلغ 20٪.Analysis softwarePerkinElmerNAVolocityScalpelSwann-Morton203No 11Super GlueLoctite1446875 95٪ O2, 5٪ CO2BOCNA< td style='العرض:300pt;'> اسطوانة< td style = 'الارتفاع: 15.5pt ؛ '> 24 بئرلوحة Corning3524 < td style = 'width: 300pt ؛ '> < td style = 'height: 15.5pt ؛ '> glass slidesThermo7107 < td style = 'width: 300pt ؛ '> 08-1.0mm thick < td style = 'height: 15.5pt ؛ '>Petri DishCorning430167 < td style = 'width: 300pt ؛ '> iDkk1 mmouseN / AN / A تم الحصول على الفئران عن طريق عبور الفئران المعدلة وراثيا tetO Dkk1 مع الفئران المعدلة وراثيا CaMKIIα rtTA2. تم تهجين الفئران المعدلة وراثيا TetO Dkk1 و CaMKIIα rtTA2 في حالة متغايرة الزيجوت. تم تربية كلا خطي الفأر في خلفية C57BL / 6J. تم استخدام زميلة الوراثية المعدلة وراثيا وWT كضوابط.الكواشف للحلول: NaClSigmaV800372 KClSigmaP9333 Na2HPO4Sigma255793 KH2PO4SigmaP9791 CaCl2Sigma223506 MgCl2SigmaM9272 NaH2PO4Sigma71505 Kynurenic acidSigmaK3375 NaHCO3SigmaS5761 حمض البيروفيكSigma107360 EDTASigmaE6758 D-GlucoseSigmaG5767 السكروزSigmaS8501 Triton-XSigmaT8787 مصل الحمارMilliporeS30-100ml PFASigmaP6148

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic MarkersImmunofluorescence StainingConfocal MicroscopyHippocampal SlicesPrimary AntibodiesSecondary AntibodiesFluorophore ConjugationColocalization AnalysisVGLUT1 AntibodyMAP2 Marker

Related Articles