مقالة منهجية

التصوير متحد البؤر لحركة الميتوكوندريا داخل الخلايا قليلة التغصن في مزارع شرائح الدماغ العضوية

918 مشاهدات

⸱

أبريل 28, 2025

في هذه المقالة

الملخص

المصدر: كينيدي ، إل إتش ، وآخرون. al. التصور والتصوير المباشر لعضيات الخلايا قليلة التغصن في شرائح الدماغ العضوية باستخدام الفيروس المرتبط بالغدة والفحص المجهري متحد البؤر. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تصوير الميتوكوندريا قليلة التغصن في شرائح دماغ الفأر العضوية. يتم وضع الشريحة داخل حجرة حمام مع دوران مستمر للسوائل ودرجة حرارة مضبوطة. بعد إعداد معلمات مختلفة للمجهر متحد البؤر ، يتم التقاط صور بفاصل زمني للميتوكوندريا ذات التألق الأحمر ، متبوعة بصور Z-stack لخلية الدبقية قليلة التغصن مع التألق الأخضر.

البروتوكول

1. تحضير شرائح النمط العضوي

ملاحظة: تستخدم هذه الوصفة صغار فأر في اليوم 7-9 بعد الولادة (ص 7-9) ، مما ينتج عنه 24 شريحة عضوية مقسمة إلى طبقين من ستة آبار. ما لم ينص على خلاف ذلك ، يجب أن تتم جميع الإجراءات في غطاء معقم ، ويجب استخدام قفازات النتريل أو اللاتكس. يجب استخدام مكونات زراعة الخلايا فقط.

  1. تم استخدام زجاجات الأوتوكلاف وأدوات التشريح (1 مقص كبير ، 1 مقص صغير ، 1 ملعقة مسطحة كبيرة ، 1 ملعقة صغيرة مستديرة وشحذة ، و 1 ملقط ؛ انظر قائمة المواد للحصول على التفاصيل) ، والماصات الزجاجية ، وأطراف الماصة ، ومناديل المناديل المبللة لتحضير الشريحة.
  2. نظرا لأنه يجب استخدام نصف الماصات الزجاجية مع الفتحة الكبيرة ، اقطع الطرف الضيق.
    1. قم بالسجل باستخدام قلم كتابة ماسي (إن وجد) حول الماصة أسفل النقطة التي يبدأ فيها الزجاج في التضييق. بعد ذلك ، ضع الطرف المدبب للماصة في قفاز النتريل أو ما شابه. اقطع الطرف بعناية عن طريق ثني الماصة أثناء دفعها على طاولة العمل.
    2. بعد ذلك ، قم بتخفيف الطرف المكسور عن طريق فركه على قطعة من ورق الصنفرة أو قم بإذابته قليلا على موقد بنسن. تستخدم الماصات المكسورة لنقل شرائح الدماغ المقطوعة، مع تحويل الطرف المكسور إلى لمبة مطاطية ويلامس الطرف المفتوح الكبير المحلول/الشرائح.
      ملاحظة: لا يتم ذلك في غطاء معقم ويمكن القيام به قبل عدة أيام.
  3. تحضير أطباق الثقافة.
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك في اليوم السابق للتقطيع أو قبل ساعتين على الأقل من التقطيع.
    1. تعقيم أغشية البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) ("قصاصات ورقية"). استخدم ملقطين معقمين لإزالة قصاصات ورق واحدة من القطع البلاستيكية الزرقاء المحيطة. بعد ذلك ، قم بالتعقيم عن طريق الغمس مرتين في طبق بتري يحتوي على 96٪ إيثانول (EtOH). ثم ضع قصاصات الورق بشكل مسطح في طبق بتري كبير معقم حتى يجف.
      ملاحظة: قصاصات الورق عبارة عن أغشية PTFE محبة للماء تشبه الأغشية الموجودة في إدخالات الثقافة. يساعد استخدام قصاصات الورق في التصوير المباشر لأنه يمكن نقل الشرائح المفردة بسهولة من الملحق إلى إعداد المجهر عن طريق رفع قصاصات الورق بالملقط (انظر 4.8. للحصول على التفاصيل). بدلا من ذلك ، يمكن زراعة شرائح الدماغ بدون قصاصات الورق (حيث تلتصق الشرائح مباشرة بغشاء إدراج الثقافة). في هذه الحالة ، يجب قطع ملحق الغشاء بمشرط لنقل الشريحة إلى حمام المجهر.
    2. أضف 1 مل من وسط الثقافة إلى كل بئر من أطباق الاستزراع المكونة من ستة آبار.
    3. ضع مزرعة واحدة في كل بئر باستخدام ملقط معقم. تجنب فقاعات الهواء بين الملحق ووسط الثقافة.
      ملاحظة: لتوفير المال والبيئة ، من الممكن إعادة استخدام إدخالات الثقافة. يمكن القيام بذلك عن طريق الشطف الشامل في الماء المقطر (dH2O) متبوعا بالحضانة في 70٪ EtOH لمدة 24 ساعة على الأقل حتى إعادة الاستخدام. عند التحضير لمزرعة جديدة ، جفف الإدخالات في لوحة زراعة الخلية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 15-30 دقيقة.
    4. ضع قصاصات (معقمة وجافة) على كل من إدخالات المزرعة. ضع قصاصات الورق باتجاه حواف الإدخالات للحصول على الحد الأدنى من التداخل.
    5. ضع الصفائح في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  4. وسط تشريح الفقاعات الباردة بغاز ثنائي الأكسيد (95٪ O 2 / 5٪ CO 2 ). للحفاظ على المحلول معقما ، قم بتوصيل الأنبوب من أسطوانة الغاز بمرشح حقنة معقم (حجم المسام 0.22 ميكرومتر).
    1. قم بإقران الطرف الآخر من مرشح المحقنة بأنبوب معقم متصل بماصة زجاجية معقمة. ضع الماصة الزجاجية في المحلول ، وقم بتغطيتها بالبارافيلم ، وقم بتشغيل الغاز. احتفظ بوسط التشريح على الجليد.
  5. تحضير منطقة التشريح / التقطيع.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يتم هذا الإجراء في غطاء معقم. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فيمكن ترك الاهتزاز على طاولة العمل. في هذه الحالة ، يوصى باستخدام شبكة الشعر وقناع الوجه.
    1. باستخدام شفرة حلاقة أحادية الحافة ، قم بقص قطعة مستطيلة (حوالي 2 سم × 0.5 سم) من جل الاغاروز وألصقها على مرحلة الاهتزاز بحيث يواجه الجانب الطويل شفرة الاهتزاز.
    2. نظف جميع الأسطح وأجزاء الاهتزاز بنسبة 70٪ EtOH وامسحها بمناديل مناديل معقمة
      ملاحظة: من المهم أن تكون جميع القطع التي ستكون على اتصال بأنسجة المخ جافة تماما لأن EtOH يمكن أن يتلف الخلايا.
    3. قم بتوصيل شفرة حلاقة معقمة بالاهتزاز وقم بإجراء فحص الاهتزاز لمعرفة ما إذا كان الاهتزاز لديه هذه الوظيفة.
    4. ضع أدوات التشريح المعقمة ، ومناديل المناديل المعقمة ، وأربعة أطباق بتري صغيرة ، ومشرط دائري الحافة ، وماصتين زجاجيتين مع بصيلات مطاطية ، وماصتين زجاجيتين مفتوحتين (انظر الجزء 1.1) ، وغراء فائق (رش ب EtOH) في الغطاء.
    5. صب وسط التشريح الفقاعي في قارب الاهتزاز وفي أطباق بتري الأربعة الصغيرة.
      ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة فقط قبل التشريح مباشرة لأن الوسيط من هذه النقطة فصاعدا لا يتم فقاعاته أو الاحتفاظ به على الجليد.
  6. تشريح وتركيب العقول.
    ملاحظة: للحصول على شرائح صحية ، يجب أن تتم هذه الخطوة بسرعة ودقة. هناك حاجة إلى بعض الممارسة.
    1. قتل # 1 عن طريق خلع الرقبة أو وفقا للإرشادات المحلية ثم قطع رأسه بالمقص الكبير.
    2. باستخدام مقص صغير حاد ، قم بإزالة الجلد بسرعة عن طريق عمل شق سهمي من الرقبة إلى الأنف واسحبه جانبا للكشف عن الجمجمة.
      1. قطع على طول الخيط السهمي ، متبوعا بشقوق جانبية على الجزء الداخلي من العظام الأمامية وخياطة لامبويد (الحدود بين المخ والمخيخ).
      2. استخدم الملقط لثني فتح الجمجمة على كل جانب. يتم قطع الأعصاب القحفية عن الدماغ عن طريق إدخال ملعقة مستديرة وحادة أسفل الجانب البطني من الدماغ وتحريك الملعقة برفق بشكل جانبي.
    3. استخدم شفرة حلاقة أحادية الحافة لعمل قطع منقاري إكليلي إلى المخيخ.
      ملاحظة: سيحدد هذا القطع الزاوية التي يتم بها قطع الشرائح. لذلك ، يجب أن يتم بزاوية مستقيمة.
    4. اقلب الدماغ من الجمجمة إلى طبق بتري صغير يحتوي على وسيط تشريح.
    5. كرر الخطوات 1.6.1. - 1.6.4. للحيوان # 2 وضع هذا الدماغ في طبق بتري ثان.
      ملاحظة: ليست عقيمة. قم بإجراء التشريح على جانب واحد من غطاء المحرك ثم انتقل إلى الجانب الآخر النظيف بمجرد إزالة الدماغ من الجمجمة.
    6. تغيير القفازات.
    7. اربط الدماغ بمرحلة الاهتزاز: أضف طبقة رقيقة من الغراء الفائق إلى المسرح أمام جل الاغاروز المركب مباشرة. امسك الدماغ # 1 بملعقة مسطحة كبيرة مع لمس الجانب المقطوع حديثا (الذيلي) الملعقة والجانب البطني المواجه (ويكون قريبا قدر الإمكان) جل الاغاروز.
      1. بعد ذلك ، ضع الدماغ برفق على الغراء عن طريق دفعه بعيدا عن الملعقة بمجموعة من الملقط. تأكد من ترك مساحة كافية للدماغ # 2.
        ملاحظة: من المهم أن تكون الأدمغة مرتبطة جيدا بالمسرح ولكن بدون غراء مفرط ، لأن هذا يمكن أن يعيق القطع.
    8. مباشرة بعد تركيب الدماغ # 1 ، استخدم الملعقة الكبيرة لإضافة بعض قطرات وسط التشريح أعلى الدماغ. سيحافظ ذلك على رطوبة الدماغ ، ويقوي الغراء ، ويمنعه من الالتصاق بجوانب الدماغ.
    9. كرر الخطوتين 1.6.7 و 1.6.8. للدماغ # 2.
    10. اربط المسرح بالقارب الاهتزازي.
  7. قطع شرائح إكليلية بسمك 230 ميكرومتر بسعة 1 - 1.5 مم ، وتردد 85 هرتز ، وسرعة 0.2 مم / ثانية. اجمع الشرائح تقريبا بين 1.4 مم منقارية و 2.1 مم ذيلية إلى Bregma.
    1. اجمع الشرائح بعد تقطيع كل شريحة باستخدام ماصات زجاجية مفتوحة الأطراف (الجزء 1.1). انقل الشرائح إلى طبق بتري يحتوي على وسيط تشريح. استخدم مشرطا مستديرا لتقطيع الشرائح إلى قطعتين ، مع تقسيم نصفي الكرة الأرضية.
  8. عندما يتم تقطيع جميع الشرائح ، ضع الشرائح في أطباق الثقافة.
    1. خذ طبق الثقافة (واحدا تلو الآخر) من الحاضنة.
    2. باستخدام الماصات الزجاجية المفتوحة ، انقل شريحة واحدة بعناية إلى كل من قصاصات الورق.
      ملاحظة: يجب أن توضع الشرائح بشكل مسطح في منتصف قصاصات الورق. هذا يتطلب بعض المهارة. ومع ذلك ، إذا لم تكن بعض الشرائح مثالية ، فمن الأفضل تركها بدلا من قضاء بعض الوقت في محاولة تحريكها ، حيث من المهم إدخال جميع الشرائح في الحاضنة في أسرع وقت ممكن.
    3. استخدم ماصة زجاجية (طرف مدبب) لإزالة الوسط الزائد برفق دون لمس الشريحة.
      ملاحظة: يجب عدم غمر الشرائح في السائل أثناء الحضانة. وبالتالي ، يجب شفط الوسط الزائد بحيث تتعرض الشرائح للهواء (سيظل غشاء رقيق من الوسط يغطي الشرائح). عادة ما تكون الشرائح التي تظل مغمورة في السائل غير صحية أو تموت (4 وملاحظاتنا).
    4. انقل الطبق مرة أخرى إلى الحاضنة بمجرد أن تحتوي كل قصاصات الورق على شريحة واحدة.
    5. كرر الخطوات 1.7.8. - 1.8.4. للطبق # 2.
  9. قم بتغيير وسيط الثقافة.
    ملاحظة: يجب أن يتم ذلك في اليوم التالي للتقطيع (اليوم 1 في المختبر ، DIV1) ثم كل 2-3 أيام.
    1. سخن وسط الثقافة في حمام مائي أو حاضنة.
    2. في غطاء المحرك المعقم ، استخدم شفطا مفرغا أو ماصة عادية ذات طرف معقم لشفط وسط الثقافة من كل بئر. يتم ذلك عن طريق قلب الطبق برفق (بحوالي 30 درجة) ووضع طرف الماصة على حافة ملحق المزرعة.
    3. قم بإزالة ما يقرب من 800 ميكرولتر من كل بئر (مع ترك وسيط كاف لإبقاء الجزء السفلي من الملحق مغطى بوسط). بعد ذلك ، باستخدام ماصة نظيفة ، أضف 800 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا إلى كل بئر. ثم ضع الأطباق مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا.

2. التنبيغ الفيروسي

  1. شراء أو صنع الفيروسات المرتبطة بالغض (AAVs) مع البلازميد المثير للاهتمام.
    ملاحظة: يصف هذا البروتوكول استخدام النمط المصلي AAV 2/8 (AAV 2/8) الذي يحمل dsred المستهدف للميتوكوندريا أو GFP كجين مراسل تحت التحكم النسخي لمحفز بروتين المايلين الأساسي 12 (AAV2 / 8 MBP_mito_dsred أو AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) لتصور الميتوكوندريا قليلة التغصن. يستخدم AAV 2/8 الذي يحمل GFP أو tdtomato كجين مراسل مدفوع بواسطة محفز CAG العام (AAV 2/8 CAG_GFP أو AAV 2/8 CAG_tdtomato) لتصور سيتوبلازم الخلايا قليلة التغصن. وبالتالي ، فإن الجمع بين AAV2 / 8 MBP_mito_dsred مع AAV 2/8 CAG_GFP يعطي الميتوكوندريا الحمراء والسيتوبلازم الأخضر في الخلايا قليلة التغصن ، في حين أن الجمع بين AAV2 / 8 MBP_mito_GFP و AAV 2/8 CAG_tdtomato يعطي الميتوكوندريا الخضراء والسيتوبلازم الأحمر. تم وصف التركيبات بمزيد من التفصيل في مكان آخر13.
  2. في اليوم 7 في المختبر (DIV7) ، يتم تحويل الخلايا قليلة التغصن مع AAVs.
    تنبيه: اتبع لوائح السلامة عند العمل مع AAVs. تأكد من حصولك على التدريب المناسب والموافقة المطلوبة على مستوى السلامة البيولوجية. يجب تنفيذ جميع النقاط التالية في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية باستخدام القفازات ومعطف المختبر. هنا ، يتم وصف تطبيق AAV على منطقة قشرة الشرائح ، حيث أن هذه هي المنطقة التي تظهر أفضل انتعاش.
    1. خفف AAV في وسط ثقافة مسخن مسبقا (37 درجة مئوية). يوصى بالتخفيفات حوالي 2 × 10 } نسخ الجينوم / مل (GC / mL) للحصول على نقل متناثر للخلايا قليلة التغصن التي تتيح تصوير الخلايا المفردة داخل الشريحة. ومع ذلك ، يجب إجراء طيار باستخدام عيار مختلف لضمان كثافة الخلايا قليلة التغصن المنقولة المناسبة للتجارب المحددة. إذا تم استخدام نوعين مختلفين من AAVs ، فيجب خلطهما في نفس المحلول وإضافتهما إلى الشريحة في وقت واحد.
    2. أضف حوالي 1.3 ميكرولتر من AAV المخفف إلى كل شريحة. تأكد من جفاف طرف الماصة من السطح. الماصة 1.3 ميكرولتر AAV المخففة وتمسك الماصة فوق القشرة في أقرب وقت ممكن دون لمس الشريحة بطرف الماصة (على بعد حوالي 1 مم).
    3. ثم ادفع المحلول ببطء خارج الماصة. عندما يلامس المحلول الشريحة ، حرك طرف الماصة فوق القشرة لنشر المحلول على منطقة القشرة بأكملها.
      ملاحظة: يجب أن يتم هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن لتجنب إبقاء الشرائح خارج غطاء المحرك لفترة أطول من اللازم. افعل ذلك على طبق واحد في ذلك الوقت وأعد الطبق الأول إلى الحاضنة قبل البدء في الطبق # 2. للحصول على توزيع مرض من AAV دون الإضرار بالأنسجة يتطلب بعض الممارسة واليد الثابتة.
  3. إذا كان المجهر الفلوري المستقيم متاحا في مختبر الخلية ، فيمكن التحقق من تعبير البروتين خلال فترة الزراعة عن طريق وضع الطبق تحت المجهر.
    ملاحظة: يجب عدم إبقاء الطبق خارج الحاضنة لأكثر من 2-5 دقائق.

3. تصوير الفاصل الزمني

ملاحظة: يمكن إجراء التصوير عندما تكون مستويات التعبير عن علامات الفلورسنت كافية ، وتبدو الشرائح صحية (عادة DIV11-14).

  1. تأكد من إعداد المجهر والتروية والتدفئة بشكل صحيح بحيث يتم تسخين محلول التصوير الفقاعي ويمكنه الدخول والخروج من الحمام.
    ملاحظة: توجد حلول مختلفة لغرف الحمام. يتم تقديم نسخة بسيطة هنا.
    1. اصنع مداخل ومخارج الحمام بواسطة إبر حقنة ضعيفة (مثنية عند ~ 45 درجة) متصلة بجانبي الحمام بواسطة بلو تاك / ممتع.
    2. تأكد من أن الأنابيب تنتقل من زجاجة من محلول التصوير الفقاعي باستمرار عبر المضخة التمعجية ، عبر أنبوب التسخين لوحدة التسخين ، ثم إلى إبرة حقنة المدخل في الحمام.
    3. قم بتوصيل أنبوب آخر بمخرج إبرة المحقنة. ثم ينتقل هذا الأنبوب عبر المضخة التمعجية ويعود إلى زجاجة محلول التصوير (أو إلى زجاجة نفايات).
  2. محلول تصوير الفقاعات بغاز ثنائي الأكسيد.
    ملاحظة: يجب أن يبدأ هذا قبل 15 دقيقة على الأقل من التصوير ويستمر طوال التجربة.
  3. قم بتشغيل المضخة التمعجية والسخان وقم بتشغيل المحلول عبر الحمام للحصول على درجة حرارة الحمام المثلى (37 ± 0.5 درجة مئوية). تأكد من غمر مستشعر مقياس الحرارة المتصل بوحدة درجة الحرارة في محلول الحمام.
  4. قم بتشغيل المجهر والمصباح الفلوري والليزر المناسب.
  5. قم بإعداد مسار إضاءة مناسب للعينة.
    ملاحظة: سيختلف هذا اعتمادا على إعداد المجهر والمسبار. مطلوب معرفة عامة بكيفية استخدام المجهر متحد البؤر ولن يتم التعامل معها هنا.
  6. استخدم هدف الغمر في الماء مع التكبير المناسب والفتحة العددية (n.a.). نحن نستخدم هدف خطة الغمر في الماء 40x (NA 1.0).
  7. افتح الثقب لتحقيق قسم بصري من 2 - 2.5 ميكرومتر تقريبا لفيديو اللقطات المتتابعة. هذا يقلل من حدوث الميتوكوندريا التي تتحرك خارج نطاق التركيز أثناء الفاصل الزمني.
  8. انقل شريحة النمط العضوي إلى الحمام:
    1. أضف قطرة من محلول التصوير أو وسط الاستزراع إلى طبق بتري بلاستيكي صغير.
    2. في غطاء المحرك المعقم ، استخدم ملقطا معقما لنقل شريحة عضوية واحدة من إدخال الغشاء إلى القطرة. يجب أن يلمس الملقط قصاصات الورق فقط وليس الشريحة.
    3. ضع الغطاء على طبق بتري.
    4. ضع طبق الثقافة الذي يحتوي على باقي الشرائح على الفور في الحاضنة.
    5. أحضر طبق بتري يحتوي على الشريحة إلى المجهر.
    6. قم بإيقاف تشغيل المضخة التمعجية أثناء نقل الشريحة إلى حمام المجهر. أولا ، استخدم الملقط لرفع قصاصات الورق مع شريحة من طبق بتري إلى الجزء العلوي من الحمام (سوف تطفو قصاصات الورق). ثم ضع طرفي الملقط على كل جانب من قصاصات الورق بحيث تلمس قصاصات الورق دون لمس الشريحة ، وادفع قصاصات الورق عبر المحلول إلى قاع الحمام. ضع قصاصات الورق في منتصف الحمام.
    7. استخدم الملقط لوضع مرساة التثبيت (القيثارة) فوق قصاصات الورق دون لمس الشريحة.
      ملاحظة: القيثارة عبارة عن مرساة بلاتينية على شكل حدوة حصان تستخدم لمنع الشريحة من الطفو أو الانجراف في الحمام. بالنسبة للشرائح الحادة ، تمتد الأوتار الرفيعة من جانب واحد من القيثارة إلى الجانب الآخر (تشبه القيثارة الموسيقية). بالنسبة للشرائح العضوية ، يجب أن تكون القيثارة بدون خيوط وتناسب حجم قصاصات الورق بحيث يمكن وضعها فوق قصاصات الورق دون لمس الشريحة.
    8. أعد تشغيل المضخة التمعجية.
  9. اخفض الهدف إلى العينة.
  10. حدد الخلية والمنطقة إلى الصورة.
    ملاحظة: تجنب التعرض المفرط للخلايا لضوء الليزر لأن ذلك قد يتسبب في سمية الخلية (انظر النصائح في النقاط أدناه).
    1. استخدم العدسات ومصباح الفلورسنت للعثور على خلية الدبقية قليلة التغصن ذات المظهر الصحي مع التعبير الصحيح. عادة ما تبدو الخلايا قليلة التغصن التي تحتوي على تعبير مفرط قوي عن البروتين الفلوري غير صحية. سيكون للخلايا قليلة التغصن غير الصحية عمليات ذات مظهر ربي ، وستظهر الميتوكوندريا مجزأة. في الخلايا قليلة التغصن السليمة ، تبدو الخلايا السوما والعمليات ناعمة ، وللميتوكوندريا أطوال مختلفة (على الرغم من أنها عادة ما تكون أقصر بكثير من الخلايا العصبية والخلايا النجمية).
    2. ضع الخلية محل الاهتمام في منتصف مجال الرؤية.
    3. استخدم وظيفة "الحية" في البرنامج (لمجاهر Leica و Zeiss) لتحديد الخلية على الشاشة واختيار مجال الاهتمام ، على سبيل المثال ، جزء من الخلية يحتوي على العديد من العمليات الأولية أو أغلفة المايلين أو عملية واحدة أو غمد المايلين.
      ملاحظة: لتتمكن من تصوير أكبر قدر ممكن من العمليات / الأغماد ، اختر المناطق التي تحتوي على عمليات مسطحة نسبيا في اتجاه xy.
    4. تكبير مجال الاهتمام (عادة ما ينتج صورة بحجم بكسل 0.14 - 0.30 ميكرومتر).
    5. باستخدام أداة "المناطق" ، ارسم مستطيلا حول المنطقة واختر خيار مسح المنطقة المحددة فقط. يتم تقليل وقت المسح ، وبالتالي التعرض لليزر ، عن طريق مسح المنطقة المحددة فقط.
      ملاحظة: سيتم مسح المناطق المستطيلة الأفقية بشكل أسرع من المناطق الرأسية بسبب العدد الأقصر من الخطوط الممسوحة ضوئيا المطلوبة. إذا تم مسح منطقة مستطيل عمودي ضوئيا، فيمكن تقليل وقت المسح عن طريق تدوير مجال المسح بمقدار 90 درجة (باستخدام أداة التدوير).
  11. اضبط قوة الليزر واكتساب للحصول على رؤية جيدة للميتوكوندريا.
    ملاحظة: استخدم الحد الأدنى من طاقة الليزر المطلوبة. إذا أمكن ، قم بزيادة الكسب بدلا من زيادة قوة الليزر. بالإضافة إلى التسبب في سمية الخلية ، فإن طاقة الليزر العالية جدا ستعمل على تبييض الأجسام المصورة بمرور الوقت ، مما يتطلب زيادة أخرى في قوة الليزر أو الكسب أثناء المسح. تعتمد قوة الليزر المطلوبة والكسب على مستوى التعبير والمجهر. باستخدام المجهر متحد البؤر LSM700 ، نستخدم ليزر 555 نانومتر بقوة 20-40 ميكروواط لتصوير dsred أو tdtomato، ويتم استخدام ليزر 488 نانومتر عند 20-30 ميكروواط لتصوير GFP (تقاس طاقة الليزر عند الفتحة الخلفية للهدف). يتم تعيين الكسب عاليا للتصوير المباشر ، وعادة ما يكون في حدود 700-800 ل GFP و 850-980 ل dsred و tdtomato. قد يتسبب الكسب العالي في حدوث المزيد من ضوضاء الخلفية ، والتي تتم إزالتها عن طريق زيادة الإزاحة الرقمية (عادة ما تكون قيم الإزاحة بين 0 و 15). في تجربتنا ، فإن استخدام MBP_mito_GFP يعطي إشارة إلى ضوضاء أفضل من MBP_mito_dsred.
  12. حدد سرعة المسح.
    ملاحظة: تقليل وقت المسح باستخدام سرعة مسح ضوئي سريعة ورسم منطقة مسح ضوئي صغيرة (انظر النقطة 4.10.5 أدناه). من الممكن أيضا توفير وقت المسح عن طريق إجراء مسح ثنائي الاتجاه. ومع ذلك ، لا ينصح بذلك بسبب ضعف جودة الصورة.
  13. اضبط تردد ومدة تسجيل اللقطات المتتابعة، على سبيل المثال، التقاط الصور كل ثانيتين بإجمالي 20 دقيقة لتصوير الميتوكوندريا في الخلايا قليلة التغصن.
    ملاحظة: يجب ضبط التكرار والمدة وفقا لحركة الأشياء ذات الاهتمام. سيؤدي التردد العالي إلى تعريض العينة لمزيد من ضوء الليزر ، لكن الأجسام ذات الحركة الأسرع تتطلب أيضا مدة إجمالية أقصر لمقاطع الفيديو ذات الفاصل الزمني (على سبيل المثال ، الميتوكوندريا في الخلايا العصبية ، التي تتحرك بشكل متكرر وبسرعة أعلى بكثير من الميتوكوندريا في الخلايا قليلة التغصن ، عادة ما يتم تصويرها كل ثانية لمدة 2 دقيقة 16).
  14. ابدأ التسجيل بفاصل زمني.
    ملاحظة: قد تخرج الميتوكوندريا عن التركيز و / أو تنجرف خارج المنطقة المصورة أثناء التسجيل. لتقليل الاهتزازات والحركة ، اضبط مداخل ومخارج الحمام وقلل من سرعة المضخة إذا لزم الأمر. عادة ما تحدث تغييرات صغيرة في التركيز. وبالتالي ، يلزم المراقبة المستمرة للشاشة أثناء التصوير ، مع تعديلات صغيرة على التركيز أثناء التسجيل.

التقط مكدس z للخلية بأكملها للتعرف المستقبلي على الخلية والعملية المصورة.
ملاحظة: للحصول على دقة أفضل ، يجب إعادة تعيين الثقب إلى وحدة واحدة جيدة التهوية ل z-stack.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = 'العرض: 549pt;'>< نمط td = 'العرض: 138pt ؛ '>BD< td style='width:131pt;'> لمبات الماصة<نمط td ='العرض:138pt;'>VWRالحرارة< td style='الارتفاع:14.5pt;width:120pt;'>D-(+)-Glucose pen< td style='width:160pt;'>54463 pipettes Blade Sciences < td style = 'width: 138pt ؛ '>Loctite < td style = 'width: 160pt ؛ '>1270884 < td style = 'width: 131pt ؛ '> استخدم لتوصيل / ضبط موضع المداخل والمنافذ في الحمام < td style = 'الارتفاع: 14.5pt ؛ العرض: 120pt ؛ '> منشفة اليد C-Fold 2< td style = 'width: 138pt ؛ '>Katrin < td style = 'width: 160pt ؛ '>344388 < td style = 'width: 131pt ؛ '> < td style = 'height: 29.5pt; العرض: 120pt ؛ ' >Harp ، Flat for RC-41 Chamber ،< td style = 'width: 160pt ؛ '>64-1418 < td style = 'width: 131pt ؛ '> harp للضغط على قصاصات ورق في الحمام. قطع الخيوط قبل الاستخدام مع شرائح عضوية. 1. 5 مم ، 13 مم ، SHD-41/15 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '>HEPES ، FW: 260.3 < td style = 'width: 131pt ؛ '> < td style = 'width: 160pt ؛ '> 96004000M< td style='الارتفاع:15.00 75pt ؛ العرض : 120pt ؛ '> مصل الحصان ، الحرارة غير معطلة < td style = 'العرض: 138pt ؛ '>Gibco-Invitrogen < td style = 'width: 160pt ؛ '> 26050-088 < td style = 'width: 131pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 120pt ؛ '>KCl < td style = 'width: 138pt ؛ '> Sigma < td style = 'width: 160pt ؛ '>P9541 < td style = 'width: 131pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 120pt ؛ '> LCR Membrane ، PTFE ،< td style='العرض:138pt;'>Millipore<نمط TD = 'الارتفاع: 15.75 نقطة ؛ العرض: 120 نقطة ؛ '>وحدة مرشح Millex-GP < td style = 'العرض: 138pt ؛ '>Millipore < td style = 'العرض: 160pt ؛ '>SLGPM33RA< td style = 'width: 131pt ؛ '> وحدة تصفية الحقنة < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '> إدراج ثقافة الخلايا الملي ، 30 مم < نمط td = 'العرض: 138pt ؛ '>Millipore < td style = 'width: 160pt ؛ '>PICM03050ثقافة الخلية<نمط td = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '>وحدة التحكم في السرعة Minipuls 3 < td style = 'العرض: 138pt ؛ '>GILSON < td style = 'العرض: 160pt ؛ '>F155001 < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '>Na2HPO4 < td style = 'العرض: 138pt ؛ '> Sigma-Aldrich < td style = 'width: 160pt ؛ '>S7907 < td style = 'width: 131pt ؛ '> < td style='الارتفاع:15.75pt;width:120pt;' >NaCl< td style='width:160pt;'>71628 < td = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض : 120pt ؛ '>Parafilm < td style = 'width: 138pt ؛ '>VWR < td style = 'width: 131pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 120pt ؛ '>paraformaldehyde ، granular Sciences < td style = 'width: 160pt ؛ '> # 19208 < td style = 'width: 131pt ؛ '> < نمط td = 'العرض: 138pt;'>SiSkiYou بتري كبير< نمط td = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '> محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) < نمط td = 'العرض: 138pt ؛ '> Sigma < td style = 'العرض: 160pt ؛ '>P4417 < td style = 'العرض: 131pt ؛ '>أقراص PBS < نمط td = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '> R2 رأس قناتين < نمط td = 'العرض: 138pt ؛ '>GILSONالمكسورة< td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '> حافة واحدة ، شفرة الأحجار الكريمة < td style = 'العرض: 138pt ؛ '>علوم المجهر الإلكتروني < td style = 'العرض: 160pt ؛ '> # 71972 < td style = 'width: 131pt ؛ '> شفرة الحلاقة أحادية الحافة < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '>سخان حل مضمن واحد SH-27B < td style = 'العرض: 138pt ؛ '>Warner Instruments < td style = 'width: 160pt ؛ '>64-0102 < td style = 'width: 131pt ؛ '> Temperature Controller - جزءالسخان< td style='height:: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '>وحدة تصفية Steritop-GP ، 500 مل ، 45 مم < نمط td = 'العرض: 138pt ؛ '>Millipore < td style = 'العرض: 160pt ؛ '>SCGPT05RE < td style = 'العرض: 131pt ؛ '> مرشح لتعقيم المحاليل < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 120pt ؛ '>دقة الغراء الفائقة < td style = 'العرض: 138pt ؛ '>Loctite < td style = 'width: 160pt ؛ '>1577386 < td style = 'width: 131pt ؛ '> < td style = 'height: 15.75pt ؛ width: 120pt ؛ '> surgical شفرة المشرط رقم 22
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AgaroseSigmaA9539
BD Microlance 19G301500Needles used in and out-of bath
Bioxide gasAGA105701
Brand pipette bullbsSigma-AldrichZ615927
موقد بنسن (موقد البروبان السائل)89038-530
تجميع الكابلات لوحدات التحكم في السخانWarner Instruments64-0106وحدة تحكم في درجة الحرارة - جزء مقياس
كلوريد الكالسيومFluka21100
Carbon CO2AGA100309CO2 for incubator
غطاء زجاجي، مربع CorningThermo Fischer Scientific13206778 to attach under bath for live image. ختم بالغراء أو هلام البنزين.
SigmaG7021
Delicate couppsFinescience11063-07For dishack
diamond scriberTed Pella Inc.
М Pasteur Glass Pasteur Pipetes 230 mmVWR612-1702Glass
Double Edge Steel RazrazorElectron Microscopy#7200شفرة الحلاقة للاهتزاز
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
Filter Paper CirclesSchleicher & Schuell3,00,220ورق الترشيح المستخدم لترشيح PFA
Fun tack
Warner Instruments
SigmaH-7006
Holten LaminAir ، Model 1.2Heto-Holten Laminar flow hood
FHLC0130Confetti
Leica VT1200Leica14048142065Vibratome
MEM-Glutamax with HEPESThermo Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Micro Spoon Heyman Type BElectron Microscopy Sciences62411-Bملعقة صغيرة مستديرة مع نهاية حادة للتشريح
إدراج
المضخة التمعجية للتصوير الحي - جزء وحدة التحكم (الاتصال برأس القنب)
Sigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka
Nunclon Delta SurfaceThermo Fischer Scientific140675Culture plate
Nystatin SuspensionSigma-AldrichN1638
الهدف W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DICZeiss441452-9900-000 هدف الغمر المائي المستخدم للتصوير الحي. (WD = 2.5 مم) ، نمط VIS-IR
291-1211
Electron Microscopy
غرفة التروية PC-R15280000EBath for Live Imaging
Penicillin-Streptomycin, liquidInvitrogen15070-063
Petri Dish 140 mmHeger1075طبق
طبق بتري 92x16 ممSarstedt82.1473Medium Petri Dish
Petridish 55x14,2 mmVWR391-0868Small طبق بتري
F117800 مضخة تمغجية للتصوير المباشر - جزء رأس قناتين (يتطلب وحدة تحكم)
ملاعق مستديرة / مسطحة, الفولاذ المقاوم للصدأVWR82027-528ملعقة كبيرة للتشريح
sand paperVWRMMMA63119اختياري، لتنعيم الماصات الزجاجية
مقص, 17,5 سمFinescience14130-17مقص كبير للتشريح
Scissors, 8,5Finescience14084-08مقص صغير حاد للتشريح
Swann Morton Ltd.209Rounded clampel blade
Temperature Controller TC324BWarner Instruments64-0100وحدة التحكم في درجة الحرارة للتصوير المباشر (تتطلب سخان الحل وتجميع الكابل)
Trizma baseSigmaT1503
Trizma HClSigmaT3253
Water jacketed incubator series IIForma Scientific78653-2882Incubator

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Z stack

مقالات ذات صلة