الفحص المجهري ثنائي الفوتون لدراسة انجذاب العملية الدبقية المجهرية نحو مركب في شريحة دماغ الفأر

الملخص

المصدر: Etienne، F. et al. التصوير ثنائي الفوتون لانجذاب العمليات الدبقية الصغيرة نحو ATP أو السيروتونين في شرائح الدماغ الحادة. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون لدراسة جاذبية عمليات الخلايا الدبقية الصغيرة نحو مركب محقون في شرائح الدماغ. يقدم نظرة عامة على تحضير شرائح دماغ الفأر ، وحقن مركب اختبار الجاذب الكيميائي ، وتصوير الخلايا الدبقية الصغيرة المسماة بالفلورسنت لتصور استجاباتها.

البروتوكول

1. الفحص المجهري ثنائي الفوتون

1. Parameters setting
   1. قم بتشغيل نظام الفوتونات المتعددة (أجهزة الكشف الهجينة ، الليزر ، الماسح الضوئي ، المغير الكهروضوئي ، المجهر). style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>NOTE:NOTE: ، not the deep-slices حيث يكون التألق التألق باهتا])، أو لتقليل سرعة الماسح الضوئي. يمكن أيضا تقليل الدقة المحورية عن طريق زيادة الخطوة z حتى 3 ميكرومتر ، ولكن نظرا لأن هذا قد يؤثر على القياس الكمي ، يجب إجراء جميع التجارب التي سيتم مقارنتها بنفس الخطوة z.
      NOTE: ^{GFP / +} وضع الشريحة والماصة الدقيقة الزجاجية ، والتطبيق المحلي للمركب
      1. قم بتوصيل المضخة التمعجية بغرفة التسجيل ، قبل 30 دقيقة من بدء التسجيل. بعد تنظيف نظام التروية بالكامل ب 50 مل من الماء عالي النقاء ، ابدأ نضح غرفة التسجيل باستخدام aCSF (50 مل) الموجود في دورق زجاجي تحت كربوجين مستمر. طوال التجربة ، حافظ على aCSF المتداول إلى 32 درجة مئوية باستخدام سخان دقيق مضمن أو سخان بلتيير.
         NOTE:الشكل 1A ، BNOTE:NOTE: NOTE: ^-1الشكل 2 ب).
      2. NOTE: ., أكثر وضوحا في الأخير مما كانت عليه في شريحة الدماغ الأولى التي يتم تصويرها). لذلك ، لا ينبغي استخدام المستويات z في أول ~ 30 ميكرومتر للتحليل ويمكن حتى تخطيها للاستحواذ
      .
      3. NOTE:2. تحليل جاذبية العمليات الدبقية الدقيقة
         1. 2D projection and drift correction
            1. افتح الملف (. LIF) مع فيجي.
            2. image/stacks/tools/Make substackZ project function (Image/Stacks/Z Project") وحدد max-intensity type الإسقاط لجعل إسقاطات z-stack المكتسبة في كل مرة نقطة.
            3. MultiStackReg Plugin/Registration/MultiStackReg), selection action 1: Align and Transformation: Rigid Bodyمعالجة البيانات
               1. افتح هذا الملف الجديد باستخدام Icy.
               2. R1تطور شدة عائد الاستثمار< نمط الامتداد = 'font-family: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المسافة البيضاء: التفاف مسبق ؛ > وقياس متوسط الكثافة على الوقت في R1.
               3. القياس الكمي للنتائج وتمثيلها
                  1. لتحديد استجابة الخلايا الدبقية الصغيرة بمرور الوقت، حدد في كل نقطة زمنية.
                     then, يمكن تمثيل النتائج كحركية للاستجابة الدبقية الصغرى ، أو في نقطة زمنية محددة (انظر الشكل 3).

النتائج

الشكل 1: تفاصيل غرفة الواجهة.(أ) مخطط تفصيلي للطباعة ثلاثية الأبعاد لحامل الشرائح. يبلغ القطر الخارجي للحامل 7 سم. (ب) حامل شريحة الواجهة مع شبكة النايلون (السهم) التي تسمح للباحثين بالاحتفاظ بالشرائح في واجهة الهواء السائل. (ج) جهاز غرفة الواجهة الذي يجعل من الممكن الحفاظ على الشرائح في بيئة مكر...

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root='1' data-sheets-baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات for slice imaging × 25 0.95 NA هدف الغمر في الماء< td style='border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '>Leica Microsystems (ألمانيا) < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '>HCX Irapo 2-photon MP5 مستقيم مجهر مع ماسحات ضوئية رنين (8 كيلو هرتز) واثنين من كاشفات HyD HybridLeica Microsystems (ألمانيا)< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> Antlia-3C Digital Peristaltic pumpDD Biolab< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>178961for 2-photon interfusion chamber with aCSF< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Carbogen 5٪ ثاني أكسيد الكربون/95٪ أكسجينAir Liquide France IndustrieI1501L50R2A001 Chameleon Ultra2 Ti:sapphire lasercoherent (Germany) < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;'> ماصات نقل يمكن التخلص منها ، فم واسع< نمط td ='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>ThermoFischer علميعلى سبيل المثال: 232-11 < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> 5.8ml مع طرف الزعنفة ، لكننا نقطعها (حوالي 7 سم) للحصول على فم بقطر 4 مم < tr style = 'الارتفاع: 24 بكسل ؛'>Emission filter SP680Leica Microsystems (ألمانيا) مكعب الفلورسنت الذي يحتوي على مرشح انبعاث 525/50 ومرشح ثنائي اللون 560 (لجمع الفلورة) < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> لايكا مايكروسيستمز (ألمانيا) < نمط td = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛>

glass coaker with 50 mL of ACSF للحفاظ على التروية المستمرة للشريحة

< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;'> < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Heating systemWarner Instrument Corporation< td style='border-bottom: 1px solid #000000؛ border-right: 1px solid #000000؛ overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: top;'>Automatic Heater Controller TC-324Bto keep the perfusion solution at 32°CPerfusion chamber < td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;s-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>-home-made, يتم توفير ملف الطباعة ثلاثية الأبعاد في المواد التكميليةSlice Slice holder ("harp")<td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:top;'> منزلية الصنع: دبوس شعر مصنوع من البلاتين مع الفرعين متصلين بخيوط نايلون متوازيةfor stimulation slice الأدينوزين 5 ′-ثلاثي الفوسفات هيدرات ملح الصوديوم (ATP) < نمط TD = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> سيجما < نمط td = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ '> A-26209 < td النمط = 'الحد السفلي: 1 بكسل صلب # 000000 ؛ الحدود اليمنى: 1 بكسل صلبة # 000000 ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أعلى ؛ المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >ليتم تحضيره مؤقتا: 1 مجم / مل (3 ملم) تم إعداد محلول المخزون في يوم التجربة ، وحفظه عند 4 درجات مئوية (بضع ساعات) ومخفف قبل الاستخدام مباشرة< tr style = 'الارتفاع: 24 بكسل ؛' >< td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-left: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '> Fluorescein (اختياري)SigmaF-6377use at 1 μM finalMicromanipulatorLuigs and NeumannSM7connected to micropipette holde-micropipette holder < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>same كما هو الحال بالنسبة للفيزيولوجيا الإلكترونيةserotonin hydrochlorideSigmaH-9523 syringe 5mL (بدون إبرة)Terumo Medical productsSS + 05S1 < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '> < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-left: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ extding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '> Transparent tubingFischer Scientific < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: top ؛ '>11750105Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubingfor image<td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> < td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> < td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Fiji https://fiji.sc IcyInstitut Pasteurhttp://icy.bioimageanalysis.org Mice CX3CR1-GFP الفئرانJung et al, 2000 CX3CR1creER-YFP fas<td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Parkhurst et al 2013< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> ذكور أو إناث, P3 إلى 2 أشهر ; لقد عكسنا هذه الفئران على خلفية 129sv.