$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. Golgi-Cox Staining
- Golgi-Cox Impregnation of Brains
- make محلول Golgi-Cox من 1٪ (وزن / حجم) ثنائي كرومات البوتاسيوم، 0.8٪ (وزن / حجم) كرومات البوتاسيوم، و 1٪ (وزن / حجم) كلوريد الزئبق عن طريق إذابة ثنائي كرومات البوتاسيوم وكرومات البوتاسيوم بشكل منفصل في مياه عالية الجودة. امزج المحاليل وأضف كلوريد الزئبق وقم بتصفية المحلول النهائي باستخدام ورق ترشيح من الدرجة 1. قم بتخزين المحلول في الظلام لمدة تصل إلى شهر واحد.
- تخدير الماوس باستخدام 5٪ isoflurane.
- قتل الماوس عن طريق قطع الرأس وإزالة الدماغ بسرعة.
- ضع الدماغ في قارورة زجاجية سعة 20 مل تحتوي على 17 مل من محلول Golgi-Cox واحتضانها في الظلام عند RT لمدة 25 يوم.
- Cryoprotect الدماغ عن طريق وضعه في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 40 مل من السكروز (30٪ (وزن / حجم) السكروز في محلول الفوسفات 0.1 M ، الرقم الهيدروجيني 7.4) في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: يمكن استخدام الخطوات الثلاث الاختيارية التالية كبديل للبروتوكول الرئيسي، من أجل تجميد الدماغ في هذه المرحلة للتخزين طويل الأجل. - قم بتجميد الدماغ بالكامل عن طريق غمره في 200 مل من الأيزوبنتان المبرد مسبقا على الثلج الجاف.
- ضع الدماغ المتجمد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتخزينه في الظلام عند -80 درجة مئوية.
- عندما تكون جاهزا للمضي قدما، قم بإذابة الدماغ عن طريق وضعه في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 40 مل من مادة السكروز المبردة واحتفظ بها في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
- Brain Sectioning
- قم بإزالة الدماغ من السكروز ومنعه من التقسيم عن طريق قطع المخيخ باستخدام شفرة حلاقة وترك حافة مسطحة في الطرف الذيلي المتبقي من الدماغ.
- سخني أجار (3٪ (وزن حجمي) في الماء) حتى يذوب ، ثم اتركه يبرد حتى يصبح أعلى قليلا من نقطة انصهاره.
- ضع الدماغ في طبق وزن صغير يمكن التخلص منه مع نهايته الذيلية مقلوبة لأسفل، وأضف كمية كافية من الأجار المذاب لتغطيته.
- بمجرد أن يصلب الأجار، قم بقص الأجار الزائد، واترك ما يقرب من 2-4 مم يحيط بالدماغ، وألصق الدماغ بمرحلة الاهتزاز مع نهايته الذيلية مقلوبة لأسفل باستخدام كمية صغيرة من غراء الإيثيل سيانواكريلات.
- املأ منطقة المسرح من الاهتزاز بكمية كافية من السكروز بالتبريد لتغطية الدماغ، وقسم الدماغ بسمك شريحة يتراوح بين 400 و500 ميكرومتر (حسب منطقة الدماغ المراد فحصها) باستخدام تردد اهتزاز يبلغ 86 هرتز وسرعة تقدم الشفرة 0.125 مم/ثانية.
- باستخدام فرشاة طلاء صغيرة، ضع أقسام الدماغ في بئر من لوحة ثقافة الأنسجة المكونة من 6 آبار تحتوي على إدخالات شبكية متوفرة تجاريا ومعبأة مسبقا ب 10 مل من 6٪ (وزن / حجم) سكروز في عازلة فوسفات 0.1 متر ، درجة الحموضة 7.4.
- احتضان الأقسام في الظلام عند 4 °C O / N.
- Developing Brain Sections
- نقل أقسام الدماغ إلى بئر جديد يحتوي على 5 مل من 2٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد (PBD) في 0.1 M من الفوسفات المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، باستخدام إدخالات الشبكة السفلية. احتضن على الروك ، وتحرك ببطء في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
- يجب غسل الأقسام مرتين عن طريق نقلها إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يجب غسلها على هزاز يتحرك بسرعة معتدلة في الظلام عند RT لمدة 5 دقائق.
- نقل الأقسام إلى بئر جديد يحتوي على 5 مل من 2.7٪ (حجم / حجم) هيدروكسيد الأمونيوم. احتضن على الروك ، وتحرك ببطء في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
- يجب غسل الأقسام مرتين عن طريق نقلها إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يجب غسلها على هزاز يتحرك بسرعة معتدلة في الظلام عند RT لمدة 5 دقائق.
- نقل الأقسام إلى بئر جديد يحتوي على 5 مل من Fixative A المخفف في الماء 10x من تركيزه الأصلي الذي تم شراؤه. احتضن على الروك ، وتحرك ببطء في الظلام في RT لمدة 25 دقيقة.
- يجب غسل الأقسام مرتين عن طريق نقلها إلى آبار جديدة تحتوي على 5 مل من الماء. يجب غسلها على هزاز يتحرك بسرعة معتدلة في الظلام عند RT لمدة 5 دقائق.
- Mounting Brain Sections
- باستخدام فرشاة رسم صغيرة، قم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر. باستخدام ملاقط ومنديل صغير ، قم بإزالة الماء الزائد والأجار. تأكد من إزالة كل أجار قبل الشروع في الجفاف.
- السماح للأقسام بالجفاف في الهواء عند RT لمدة 45 دقيقة تقريبا (أقسام 400 ميكرومتر) أو 90 دقيقة (أقسام 500 ميكرومتر).
NOTE: التوقيت والمستوى المناسب للجفاف أمران حاسمان وقد يلزم تحديدهما في كل مختبر اعتمادا على درجة الحرارة المحيطة والرطوبة. يؤدي وقت التجفيف القصير جدا إلى سقوط الأقسام من الشرائح أثناء خطوات التجفيف اللاحقة ، ويؤدي وقت التجفيف الطويل جدا إلى تشقق الأقسام. ستظل الأقسام تبدو لامعة عند المستوى المناسب من الجفاف. - صبغة الأقسام باللون البنفسجي cresyl عن طريق وضع الشرائح في برطمانات تلطيخ Coplin كما هو موضح.
NOTE: يمكن استخدام هذه الخطوة الاختيارية للأقسام التي لم يتم تجميدها مطلقا لتلطيخ النوى العصبية باللون البنفسجي الكريسيل. لقد وجدنا أن إزالة الأقسام وإعادة ترطيبها قبل الحضانة في البنفسج الكريسيل يؤدي إلى تلطيخ متساو وخلفية منخفضة عبر الأقسام.- ضعه في عامل المقاصة لمدة 5 دقائق.
- ضعه في 100٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق.
- ضع 95٪ إيثانول في الماء، ثم 75٪ إيثانول في الماء، ثم 50٪ إيثانول في الماء لمدة دقيقتين لكل منهما.
- ضعه في الماء لمدة 5 دقائق.
- ضعه في 0.5٪ (وزن / حجم) كريسيل البنفسجي في الماء لمدة 7 دقائق.
- ضعه في الماء لمدة دقيقتين.
- قم بتجفيف الأقسام عن طريق وضع الشرائح في برطمانات تلطيخ Coplin كما هو موضح.
- ضع في 50٪ إيثانول في الماء، ثم 75٪ إيثانول في الماء، ثم 95٪ إيثانول في الماء لمدة دقيقتين لكل منهما.
- ضعه في 100٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق.
- ضعه في عامل المقاصة لمدة 5 دقائق.
NOTE: أوقات الجفاف والتطهير هذه كافية لمعالجة أدمغة الفئران كما هو موضح في هذه المخطوطة. ومع ذلك ، فقد لاحظنا أنه بالنسبة للأنواع الأخرى ، بما في ذلك الجرذان وطيور البقر ، قد تحتاج خطوة المقاصة النهائية إلى التمديد حتى 15 دقيقة في المجموع.
- Coverslip sections باستخدام وسيط تركيب لا مائي.
- السماح للشرائح بالجفاف أفقيا في الظلام عند RT لمدة 5 أيام على الأقل.
2. تصوير الخلايا العصبية الملطخة داخل أقسام
- الدماغ السميكةcapture image stacks
- قم بتشغيل المصباح الكهربائي المجهري والكاميرا ووحدة التحكم في المسرح.
- افتح برنامج المجهر (على سبيل المثال، Neurolucida).
- ضع شريحة على مرحلة المجهر.
- التقط صورة ثنائية الأبعاد واسعة الرؤية لقسم الدماغ باستخدام هدف تكبير منخفض مثل 1.25X 0.4 NA PlanAPO أو 4X 0.16 NA.
- ركز على الصورة واضبط إعدادات الكاميرا، بما في ذلك وقت التعرض وتوازن البياض.
- إنشاء نقطة مرجعية بالنقر بزر الماوس الأيسر في أي مكان في القسم
- التقط الصورة عن طريق تحديد "الحصول على صورة واحدة" في نافذة الحصول على الصور.
- التقط مجموعات صور متوسطة الدقة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية (الخلايا العصبية) ذات الأهمية باستخدام هدف 10X 0.3 NA UPlan FL N.
- ركز على الصورة واضبط إعدادات الكاميرا، بما في ذلك التعريض الضوئي وتوازن اللون الأبيض.
- قم بتعيين الحدود العلوية والسفلية لمجموعة الصور عن طريق التركيز على الجزء العلوي من القسم وتحديد "تعيين" بجوار "أعلى المكدس" داخل نافذة الحصول على الصور، ثم التركيز على أسفل القسم وتحديد "تعيين" بجوار "أسفل المكدس" داخل نافذة الحصول على الصور.
- اضبط مسافة الخطوة على 5 ميكرومتر عن طريق إدخال "5 ميكرومتر" بجوار "المسافة بين الصور" داخل نافذة الحصول على الصورة.
- التقط مجموعة الصور عن طريق تحديد "الحصول على مكدس الصور" داخل نافذة الحصول على الصور.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لالتقاط منطقة الاهتمام بأكملها، مع التأكد من تداخل جميع مكدسات الصور بنسبة 10٪ على الأقل في المحورين X وY.
- التقط مداخن صور عالية الدقة للمنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية ذات الأهمية باستخدام هدف غمر زيت السيليكون 30X 1.05 NA.
- ضع 3-4 قطرات من زيت الغمر السيليكوني على الشريحة وضع الهدف فوق الشريحة، مما يضمن الاتصال بين الهدف والزيت.
- ركز على الصورة واضبط إعدادات الكاميرا، بما في ذلك التعريض الضوئي وتوازن اللون الأبيض.
- قم بتعيين الحدود العلوية والسفلية لمجموعة الصور عن طريق التركيز على الجزء العلوي من القسم وتحديد "تعيين" بجوار "أعلى المكدس" داخل نافذة الحصول على الصور، ثم التركيز على أسفل القسم وتحديد "تعيين" بجوار "أسفل المكدس" داخل نافذة الحصول على الصور.
- اضبط مسافة الخطوة على 1 ميكرومتر عن طريق إدخال "1 ميكرومتر" بجوار "المسافة بين الصور" داخل نافذة الحصول على الصورة.
- التقط مجموعة الصور عن طريق تحديد "الحصول على مكدس الصور" داخل نافذة الحصول على الصور.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لالتقاط منطقة الاهتمام بأكملها، مع التأكد من تداخل جميع مكدسات الصور بنسبة 10٪ على الأقل في المحورين X وY.
- احفظ ملف البيانات وجميع ملفات الصور بتنسيق TIFF للمعالجة الخارجية.
- إنشاء صور إسقاط Z ومونتاج الصور
- Create Z-projection images in ImageJ
- افتح برنامج ImageJ الذي مثبت عليه المكون الإضافي Bio-Formats.
- select "Plugins" -> "Bio-Formats" -> "Bio-Formats Importer".
- حدد ملف مكدس الصور المراد فتحه.
- بمجرد فتح الملف، قم بتغيير التنسيق إلى RGB عن طريق تحديد "صورة" -> "النوع" -> "RGB Color".
- create z-projection عن طريق تحديد "صورة" -> "مكدسات" -> "Z Project...".
- احفظ صورة الإسقاط Z ثنائية الأبعاد كملف TIFF.
- قم بإنشاء مونتاج صورة ثنائي الأبعاد لمنطقة الاهتمام بأكملها.
- افتح البرنامج (على سبيل المثال، Adobe Photoshop).
- select "File" -> "Automate" -> "Photomerge".
- select "استعراض" ثم أضف جميع ملفات الصور المراد دمجها.
- تأكد من تحديد "مزج الصور" ثم حدد "موافق".
- احفظ صورة المونتاج الناتجة لمنطقة الاهتمام بأكملها كملف TIFF.