تصوير تنشيط الخلايا العصبية في الحصين في أقسام دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Provenzano، G.، et al. التصور الكيميائي المناعي لنشاط الخلايا العصبية في الحصين بعد التعلم المكاني في نموذج فأر لاضطرابات النمو العصبي. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو التصوير الكيميائي المناعي لتصور تنشيط الخلايا العصبية في الحصين. تكشف أقسام الدماغ الملطخة عن مناطق أكثر قتامة تحت مجهر المجال الساطع ، مما يشير إلى الخلايا العصبية المنشطة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.

1. Immunohistochemistry

1. انقل 3-5 أقسام الحصين الظهرية لكل فأر إلى 24 لوحا متعدد الآبار تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.1 M (PBS) لكل بئر.
2. اغسل الأقسام الموجودة في كل بئر بسعة 500 ميكرولتر من 0.1 M PBS (5 دقائق، 3 مرات مع رج لطيف).
3. إخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي عن طريق احتضان أقسام في بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 1٪ (H₂O₂) في PBS لمدة 20 دقيقة مع تحريض لطيف.
4. اغسل الأقسام في 0.1 M PBS مع تحريك لطيف (3 × 5 دقائق).
5. نفاذية الأنسجة: احتضان الأقسام لمدة 5 دقائق في 0.2٪ Triton X-100 في PBS.
6. خلال الخطوات المذكورة أعلاه (1.4؛ 1.5)، قم بعمل مخزن مؤقت مانع كاف (10٪ مصل الماعز و 0.1٪ Triton-X100 في PBS) للتجربة بأكملها (عدد الأقسام × 100 ميكرولتر × 3 خطوات).
7. NOTE: استخدم مصلا من نفس النوع الذي صنع فيه الجسم المضاد الثانوي (Ab) (المقترن بالبيوتين).
8. منع الارتباط غير المحدد للجسم المضاد عن طريق احتضان الأقسام في مخزن مؤقت مانع (100 ميكرولتر / مقطع) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع تحريض لطيف.
9. احتضان الأقسام في كيناز Ab المنظم للإشارة خارج الخلية (pERK) الفسفوري الأولي المخفف في المخزن المؤقت المانع بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية، مع تحريض لطيف.
10. اغسل الأقسام في 0.1 M PBS مع تحريك لطيف (3 × 5 دقائق).
11. احتضن مع Ab الثانوي المقترن بالبيوتين (1:250) المخفف في المخزن المؤقت المانع (كما هو مستخدم في الخطوة 1.6) لمدة ساعة واحدة في RT مع تحريض لطيف.
12. قم بإعداد كاشف مركب أفيدين-بيوتين (ABC) في نفس الوقت، حيث يتطلب أفيدين والبيوتين 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة حتى يتجمع.
13. قم بإعداد الحجم المطلوب من كاشف ABC وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
14. اغسل الأقسام في 0.1 M PBS مع تحريك لطيف (3 × 5 دقائق).
15. احتضن الأقسام لمدة 45 دقيقة في RT باستخدام كاشف ABC.
16. اغسل الأقسام في 0.1 M PBS مع تحريك لطيف (3 × 5 دقائق).
17. لإعداد حل عمل diaminobenzidine (DAB), يجب أن تتم كل خطوة تنطوي على DAB في غطاء الدخان, كما DAB مادة مسرطنة ومجيءة.
18. انقل محلول DAB إلى لوحة جديدة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.
19. ضع الأقسام في اللوحة التي تحتوي على محلول عمل DAB وقم بتدوير اللوحة يدويا ببطء للسماح بأقصى قدر من التعرض للأقسام.
20. راقب تفاعل DAB على المجهر حتى تتطور الإشارة الكافية (2-5 دقائق).
21. أوقف التفاعل بكثافة اللون المطلوبة عن طريق غسل الأنسجة في 0.1 M PBS (3 × 5 دقائق).
22. استخدم المبيض لإلغاء تنشيط أي محلول ركيزة DAB متبقي في غطاء الدخان طوال الليل والتخلص منه وفقا لإرشادات المختبر.
23. قم بتركيب الأقسام على الشرائح المطلية بالجيلاتين عن طريق تعويمها في PBS. ثم جففها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 ساعات على الأقل.
24. قم بتجفيف الأقسام بالتتابع بنسبة 50٪ و 70٪ و 95٪ و 100٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين لكل منهما وقم بإزالتها بنسبة 100٪ زيلين لمدة 5 دقائق.
25. Coverslip باستخدام وسيط التثبيت واتركه في غطاء الدخان حتى يجف طوال الليل.

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "العرض: 799pt;'>< td style = 'الارتفاع: 29.0 نقطة ؛ العرض: 148 نقطة ؛ '>Xylene < td style = 'العرض: 171pt ؛ '>VWR< td style = 'العرض: 169pt ؛ '>66004-950 < td style = 'width: 311pt ؛ '> Toxic - لاستخدامه تحت غطاء المحرك. قم بتغيير الزيلين كل شهر حسب الاستخدام.< td style='الارتفاع:14.5pt;width:148pt;'>PBS<نمط td = 'الارتفاع: 43.5pt ؛ العرض: 148pt ؛ '>DAB peroxidase substrate < td style = 'width: 171pt ؛ '>Vector Laboratories < td style = 'width: 169pt ؛ '>SK-4100 < td style = 'width: 311pt ؛ '> أضف حجم 5 مل من الماء المقطر المزدوج: قطرتان من محلول المخزون العازل واخلطه ؛ 4 قطرات من DAB واخلطها ؛ 2 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين واخلطها.< td style='الارتفاع:14.5pt;width:148pt;'>SuperFrost Slides

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
24 well plate	Sigma	CLS3524
100٪ ethanol	Fisher Scientific	A406-20	يستخدم لصنع تدرج الإيثانول للجفاف قبل تركيب الشريحة.
Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal goat serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	أضف حجم 5 مل من PBS 2 قطرات من الكاشف أ ، واخلطه ثم أضف قطرتين من الكاشف B واخلطه.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
biotinylated goat antibody IgG المضاد للأرانب	Vector Laboratories	BA-1000	التخفيف 1:250
Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	تركيب وسيط للشرائح. يمكن استخدام وسط التركيب المكافئ.