تصوير ديناميكيات ATP داخل الخلايا باستخدام مستشعرات قائمة على FRET في شريحة حصين الفأر العضوي

الملخص

المصدر: Lerchundi, R., et. al. تصوير ATP داخل الخلايا في شرائح الأنسجة العضوية لدماغ الفأر باستخدام المستشعر القائم على FRET ATeam1.03YEMK. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو استخدام أجهزة الاستشعار القائمة على FRET (نقل طاقة الرنين الفلوري) لقياس مستويات ATP داخل الخلايا في شرائح الحصين الفأرية العضوية ، مما يتيح التصور في الوقت الفعلي لديناميكيات ATP في الخلايا العصبية والخلايا النجمية في ظل الظروف الفسيولوجية والتجريبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. تصوير ATP المستند إلى FRET ( الشكل 1)

1. قبل التجربة ، قم بإعداد E-ACSF وقم بفقاعاته بنسبة 95٪ O ₂ / 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة على الأقل للحصول على درجة حموضة 7.4. قم بتشغيل مصدر ضوء الفلورسنت (مصباح الزينون) للأحادي اللون ( الشكل 1 ). ابدأ التروية قبل إخراج الشريحة من الحاضنة مباشرة.
   ملاحظة: احتفظ بالمحلول الملحي مع 95٪ O ₂ و 5٪ CO ₂ خلال التجربة بأكملها.
2. انقل الشريحة إلى غرفة تجريبية يتم تغليفها باستمرار باستخدام E-ACSF المكربوغني حديثا باستخدام مضخة تمعجية ( الشكل 1 ). ثم قم بإصلاح الشريحة بشبكة. ضع الغرفة على مرحلة المجهر وقم بتوصيل نظام التروية. يوصى باستخدام أنابيب مختبرية مقاومة للغاز للتروية.
   ملاحظة: يمكن إجراء التجارب في درجة حرارة الغرفة أو بالقرب من درجة الحرارة الفسيولوجية ، اعتمادا على التصميم التجريبي. تحقق من استقرار وموثوقية تدفق التروية لتجنب التغيرات في التركيز الناجمة عن حركة الأنسجة و / أو التغيرات في إجهاد القص. سرعات التروية القياسية لعمل الشرائح ، التي نستخدمها والعديد من المختبرات الأخرى ، هي 1.5-2.5 مل / دقيقة.
3. اجعل الشريحة المستنبتة في بؤرة التركيز باستخدام ضوء الإرسال. تحديد المنطقة التي يجب إجراء التجارب فيها (على سبيل المثال: منطقة CA1 من الحصين). قبل البدء في تجارب التصوير، انتظر 15 دقيقة على الأقل للسماح للشرائح بالتكيف مع الظروف المالحة. لتكوين الإعداد التجريبي، راجع الشكل 1.
4. قم بتشغيل الكاميرا وبرنامج التصوير. ثم حدد مكعب المرشح المناسب.
5. إثارة البروتين الفلوري المتبرع (eCFP) عند 435/17 نانومتر (~ 435 نانومتر). اضبط وقت التعريض بين 40 إلى 90 مللي ثانية.
   } ملاحظة: قد يؤدي التعرض القوي للشرائح لضوء الفلورسنت إلى تأثيرات سامة ضوئية.
6. ينتج عن الإثارة عند 435 نانومتر انبعاث عند كل من 475 نانومتر (eCFP ؛ مانح) و 527 نانومتر (كوكب الزهرة ؛ متقبل). قم بتقسيم انبعاث التألق عند 500 نانومتر باستخدام مقسم صورة الانبعاث واستخدم مرشحات ممر النطاق عند 483/32 و 542/27 لزيادة عزل مضان المتبرع والمستقبل. قد يؤدي التعبير القوي إلى تشبع أجهزة الكشف. في هذه الحالة ، يمكنك استخدام مرشح كثافة محايدة لتقليل شدة الإثارة.
7. حدد منطقة اهتمام (ROI) خالية على ما يبدو من التألق الخلوي لطرح الخلفية. ثم قم بإنشاء عائد استثمار يحدد أجسام الخلايا.
8. اضبط تكرار الحصول على الصورة ووقت التسجيل الإجمالي. بالنسبة للتجارب الطويلة (>30 دقيقة) ، يوصى بتردد اكتساب 0.2-0.5 هرتز لمنع السمية الضوئية.
9. ابدأ التسجيل. يوصى بالتسجيل لمدة 5 دقائق على الأقل في ظل ظروف خط الأساس لضمان استقرار التحضير.
   ملاحظة: اضبط تركيز الخلية أثناء التسجيل إذا لزم الأمر.

النتائج

الشكل 1: تكوين إعداد تصوير FRET. (أ) رسم تخطيطي للمكونات المختلفة وترتيبها المكاني المطلوب لإعداد التصوير FRET. يتكون الترتيب من أحادي اللون مع مصباح زينون كمصدر للضوء ، ومجهر ...

المواد

< فئة الشكل = نمط الجدول = 'العرض: 747pt ؛ '><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2-deoxyglucoseAlfa AesarL07338 anti-non-metabolization glucose analog< td style='height:: 14.5pt;width:204pt;'>Band pass filters 483/32AHF Analysentechnik AG مرشح الإخراج المتوافق مع الفقسممرشحات تمرير النطاق 542/27AHF Analysentechnik AG مرشح التضمين المتوافق مع الفقسم Beamsplitter T 455 LP < td style = 'width: 119pt;'>AHF Analysentechnik AG Excitation dichroic mirrorBeamsplitter T 505 LPXRAHF Analysentechnik AG Splitter dichroicData processing Origin Pro 9.0.0 (64- bit)OriginLab corporation Scientific graphing and data analysis softwareD-glucose monohydrateCaelo2580-1kg DPBSGIBCO/Life14190250Dulbecco's Saved Saved SalineEclipse E 600FN upright microscopeNikon Microscope Solutions Eclipse FN1 upright microscope Nikon Microscope Solutions Experimental chamberCustom build Perfusion Chamber for Live cell imagingHanks' Balanced Salt SolutionSigma-AldrichH9394مع الفينول الأحمر لمراقبة الأس الهيدروجينيMinimum Essential Medium EagleSigma-AldrichM7278Synthetic cell culture mediaMonochromator Polychrome VThermo Scientific/FEI Ultra speed تبديل أحادي اللون < نمط TD = 'الارتفاع: 15.75 نقطة ؛ العرض: 204 نقطة ؛ '>نيكون فلور 40x / 0.80 واط DIC M ∞ / 0 WD 2.0< td style = 'العرض: 119pt ؛ '>Nikon Microscope Solutions< td style = 'width: 106pt ؛ '> < td style = 'width: 318pt ؛ '> الماء الغمر المجهر الهدف < td style = 'الارتفاع: 15.75pt ؛ العرض: 204pt ؛ '>NIS Elements 4.50 Advanced Research < td style = 'width: 119pt ؛ '>Nikon Microscope Solutions < td style = 'width: 106pt ؛ '> < td style = 'width: 318pt ؛ ' > برنامج التصوير. نسخة مطورة لتصوير FRET< td style = 'height: 15.75pt;width:204pt;'>ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonics Digital CMOS cameraPerfusion tubingPro Liquid GmbH Tygon tubeing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) Photoshop CS 6 الإصدار 13.0Adobe Image processing softwaressAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)ETH Zürichv244ناقل AAV أحادي الشريطة يحفز التعبير عن ATeam1.03YEMK تحت سيطرة جزء المحفز المشبك البشري 1 hSyn1.ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)ETH Zürichv307 متجه AAV أحادي الشريطة يحفز التعبير عن ATeam1.03YEMK تحت سيطرة جزء محفز البروتين الحمضي الليفي الدبقي البشري ABC1D.