تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالنماذج الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. تحضير الماوس للحصول على الصور
- فأر التخدير للتصوير
ملاحظة: للتخفيف من التعرض للأيزوفلوران ، تأكد من تنظيف غاز النفايات بشكل مناسب. تأكد من توصيل منفذ العادم لغرفة تحريض التخدير بعلبة مرشح غاز الكسح السلبي ومخرج أنف تخدير الفأر بعلبة مرشح غاز الكسح النشطة مع فراغ يوفره جهاز تفريغ الغاز. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لمراقبة وزن علبة الفلتر لاستبدالها. - قم بتخدير الفأر باستخدام كوكتيل الكيتامين / الزيلازين. بدلا من ذلك ، قم بتحفيز التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران إذا كنت تستخدم أيضا إيزوفلوران للحفاظ على التخدير (جلسة التصوير > 30 دقيقة). اضبط جهاز تخدير الصغيرة لملء حجرة الحث بنسبة 5٪ من الأيزوفلوران الممزوج بهواء الغرفة بمعدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة. ضع الماوس في حجرة الحث ، واترك 15 ثانية حتى يصبح الفأر مخدرا.
- قم بتبديل مبخر الأيزوفلوران إلى 0٪ وقم بتوجيه تدفق التخدير إلى قطعة الأنف. قم بإجراء "O2 flush لمدة 5 ثوان من غرفة الحث. أخرج الماوس من حجرة الحث ، وثبته في حامل الرأس ، وقم بتوصيل قطعة الأنف.
- استخدم مزيجا من 1٪ إيزوفلوران مع هواء الغرفة بمعدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة للحفاظ على التخدير. راقب معدل التنفس على فترات مدتها 5 دقائق طوال فترة التخدير ، واضبط نسبة الأيزوفلوران للحفاظ على معدل تنفس ~ 60 نفسا / دقيقة.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام هذه الإعدادات (٪ إيزوفلوران ، معدل التدفق) للحفاظ على التخدير الناجم عن كوكتيل الكيتامين / الزيلازين.
- اتساع حدقة العين
- تحضير محلول 1٪ وزن / حجم الأتروبين و 2.5٪ وزن / حجم فينيليفرين هيدروكلوريد في الماء. قم بتخزين محلول الموسع في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
- باستخدام قطارة العين الماصة التي تستخدم لمرة واحدة ، ضع قطرة من محلول الموسع على كل عين سيتم تصويرها. أطفئ أضواء الغرفة وانتظر 5 دقائق حتى يتمدد التلميذ. عندما يتسع حدقة العين ، امسح محلول الموسع بأنسجة خالية من النسالة.
ملاحظة: تأكد من عدم دخول محلول الموسع إلى الخياشيم. - ضع قطرة كبيرة من جل العين المزيوت على كل عين سيتم تصويرها. إذا كان سيتم تصوير كلتا العينين ، فضع قطعة صغيرة من غشاء بلاستيكي على جل العين على العين غير التصويرية لمنع الجفاف. إذا كنت تصور عين واحدة فقط ، فضع مرهم العين المزلق على العين التي لن يتم تصويرها.
- وضع الماوس للتصوير
- لتأمين الماوس في حامل رأس التصوير، قم بتدوير الذراع الرئيسي لحامل الرأس حتى يميل قضيب سماعة الأذن بزاوية 60 درجة أو أكثر أسفل الأفقي. قم بتأمين دبوس قناة الأذن السفلية في الوضع الممتد إلى الداخل ودبوس قناة الأذن العلوية في الوضع المسحب.
- مع مواجهة الماوس لقضيب العض ، قم بتركيب أذن واحدة على الدبوس السفلي الممتد ، وأدخل الدبوس في قناة الأذن. قم بفك المسمار المثبت لدبوس قناة الأذن العلوية ، وقم بتمديد الدبوس إلى قناة الأذن الأخرى. شد المسمار لتأمين الرأس.
- حرك شريط العض باتجاه رأس الماوس. ارفع رأس الماوس برفق ، ثم اخفض القواطع الفكية للفك العلوي في فتحة شريط اللدغة. اسحب قضيب العض بقوة لطيفة لتأمين رأس الماوس ، وقم بتأمين موضع قضيب العض عن طريق شد المسمار.
- في حالة استخدام الأيزوفلوران ، حرك قطعة الأنف من خلال فتحتها على قضيب العض قبل تثبيت قواطع الماوس. قم بتأمين وشد موضع قضيب العض كما في الخطوة 1.3.3. شد قطعة الأنف باستخدام المسمارين الموجودين على وجهها العلوي حتى تتناسب بشكل مريح مع أنف الماوس ، لكنها لا تضيق الخطم.
- انقل الماوس ، في حامل الرأس ، إلى مرحلة المجهر أسفل الهدف. قم بتدوير الذراع الرئيسي لحامل الرأس حتى يتم توجيه تلميذ العين بشكل مستقيم لأعلى ، بما يتماشى مع مسار الضوء ( الشكل 1 ).
- ضع غطاء # 1.5 في حامل الفلتر المضغوط وقم بتوصيل الحامل بمرحلة المجهر. اخفض الغطاء باتجاه العين ، مع ملامسة جل العين المزيق ، بحيث يقع أفقيا فوق القرنية مباشرة ( الشكل 1 ). تأكد من أن الغطاء لا يلمس القرنية.
ملاحظة: على المجهر ، تأكد من ضبط مسار ضوء الإثارة على التألق السطحي وضبط مسار ضوء الانبعاث على العدسة. قم بتشغيل مصباح التألق بأقل طاقة له وافتح غالق الإضاءة. اختر الطول الموجي لمصباح التألق ومرشح التألق المقابل للفلوروفور الذي يتم تصويره. - قم بمناورة المرحلة بأبعاد XY والهدف في الموضع Z باستخدام التحكم في المسرح ومحرك التركيز البؤري الآلي حتى يغطي ضوء الإثارة واسع المجال القرنية بالكامل. بالنظر من خلال العدسة ، استمر في ضبط موضع Z للمرحلة حتى يتم التركيز على الخلايا الفلورية أو الهياكل في شبكية العين. قم بزيادة قوة إضاءة التألق إذا كانت إشارة العينة غير ساطعة بما يكفي لحل الخلايا الفردية أو الهياكل ذات الأهمية من خلال العدسة.
ملاحظة: إذا كنت تواجه مشكلة في تحديد موقع شبكية العين ، فإن القزحية هي معلم عالي التباين للتثبيت عليه ثم التركيز لأسفل نحو شبكية العين. ستسمح هذه الخطوة أيضا بالتحقق من أن التلميذ متسع إلى أقصى حد. - احصل على منطقة تصوير على المحور باستخدام عدسة الماوس. اضبط زاوية الماوس باستخدام درجات الحرية المختلفة على حامل الرأس حتى يحدث تمدد أو انكماش فقط للضوء خارج نطاق التركيز البؤري عند ضبط المستوى البؤري. قم بإيقاف تشغيل مصباح التألق وأغلق غالق الإضاءة.
ملاحظة: يشير اختلاف المنظر XY الكبير للضوء خارج نطاق التركيز البؤري أثناء التمرير عبر المستويات البؤرية للاتجاه Z إلى أن شبكية العين ليست على المحور فيما يتعلق بمسار ضوء التصوير.
2. الحصول على الصور ثنائية الفوتون
- {{}} إعداد الصورة ومعلمات الحصول عليها
ملاحظة: أطفئ أضواء الغرفة وقم بتغطية مصادر الضوء الشاردة في الغرفة. تأكد من إيقاف تشغيل مصباح الإضاءة، وإغلاق مصراع الإضاءة. - قم بتبديل مسار ضوء الإثارة إلى الليزر ومسار ضوء الانبعاث إلى أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs).
- في برنامج الحصول على الصور ، قم بتعيين حجم إطار 512 × 512 ومتوسط إطار 3. اضبط الخطوات لكل شريحة على -8 ميكرومتر. قم بتعيين z-stepping للبدء في الجزء العلوي من المكدس والتقدم لأسفل ، مما يقلل من تنشيط الليزر ثنائي الفوتون للمستقبلات الضوئية.
ملاحظة: يمكن تقليل حجم الخطوة لزيادة دقة Z بتكلفة زيادة وقت التصوير ، ولكن خطوات 8 ميكرومتر كافية لحل سوماتا الخلية في تكوين التصوير هذا. - قم بتشغيل وتمكين PMTs. اضبط جهد PMT على 680 فولت. قم بتمكين غالق الإثارة.
ملاحظة: PMTs التي تعمل بالطاقة عرضة للتلف الضوئي. تأكد من إيقاف تشغيل مصباح التألق ، وسحب ستارة حاوية المجهر ، وإطفاء أضواء الغرفة. - ابدأ معاينة الصورة الحية للأنسجة المستهدفة ، بدءا من طاقة الليزر بنسبة 1٪. اضبط سطوع الشاشة تلقائيا لتصور الخلايا أو الهياكل ذات الاهتمام. اضبط مرحلة المسح تلقائيا. إذا كان النسيج المستهدف خافتة أو غير واضح ، فقم بزيادة النسبة المئوية لطاقة الليزر حتى تصبح الهياكل مرئية دون تجاوز الحد المحدد في الخطوة 2.4.4 ، والذي يتوافق مع 45 ميجاوات.
ملاحظة: بالنسبة لصورة 16 بت، تشير قيمة العرض ~ 1000 عند الضبط التلقائي للسطوع في مستوى Z يحتوي على هياكل ذات أهمية إلى سطوع كاف للعينة. - قم بمناورة مرحلة المجهر في اتجاه XY لتمركز في منطقة التصوير المرغوبة ، ثم انتقل إلى المستوى Z مع التركيز البؤري على الهياكل ذات الاهتمام.
ملاحظة: يسمح التصوير المجاور لرأس العصب البصري بالعمل كمعلم لا لبس فيه لتجارب التصوير المزمن. - إذا كانت هذه تجربة بفاصل زمني مزمن ، فافتح صورة سابقة على كمبيوتر الاستحواذ واستخدمها كمرجع للعثور على نفس مجال الاهتمام. تأكد من أن زاوية التصوير مشابهة لزاوية الصور السابقة للحصول على نفس مجموعة الخلايا مع الحد الأدنى من المنظر.
ملاحظة: لتصوير نفس الخلايا كما في النقاط الزمنية السابقة ( الشكل 2 ) ، من المحتمل أن يكون هناك حاجة إلى مزيد من التعديل لموضع رأس الماوس. - قم بتعيين حدود Z لمكدس التصوير من خلال الانتقال إلى مستويات Z العلوية والدنيا ذات الأهمية ، والحصول على الصورة. عند الانتهاء من الحصول على الصور ، قم بتعطيل PMTs ومصراع الانبعاثات. قم بتبديل مسار ضوء الانبعاث مرة أخرى إلى العدسة ، ومسار ضوء الإثارة إلى إضاءة التألق. قم بإزالة الماوس من مرحلة المجهر.
