التصوير الفلوري لديناميكيات المناعة العصبية باستخدام غرسة الجمجمة

الملخص

المصدر: Bisht, K., et al. رسم خرائط دقيقة للدماغ لإجراء تصوير متكرر في الجسم الحي لديناميكيات المناعة العصبية في الفئران. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو التصوير الفلوري لديناميكيات المناعة العصبية في فأر معدل وراثيا مع زرع جمجمة. يتم تصوير استقرار الأوعية الدموية والخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع التغيرات الدبقية الصغيرة الديناميكية ، مما يعكس الاستجابات المناعية لنشاط الخلايا العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير الفأر لزرع نافذة الجمجمة

} ملاحظة: خطوط الفأر المعدلة وراثيا المختلفة مع علامات الفلورسنت مناسبة للتصوير.

1. استخدم الفئران CX3CR1GFP / + لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي. عادة ، يتم استخدام الفئران من الأحداث إلى الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين 4 و 10 أسابيع والتي تزن 17-25 جم.
   ملاحظة: على الرغم من أن هذا النهج مناسب حتى للفئران التي تم فطامها مسبقا ، إلا أن الحاجة إلى إعادة الفئران إلى أقفاصها مع أمهاتها للتغذية قد تعقد الشفاء إذا لم تعتني الأم بالجراء بشكل كاف بعد الجراحة. لذلك ، يوصى باستخدام الفئران بعد الفطام.
2. تخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران (تدفق 5٪ في الأكسجين للحث لمدة 1 دقيقة) في غرفة التخدير. تأكد من أن الماوس لا يظهر أي حركة أو استجابات ارتعاش لقرصات إصبع القدم و / أو الذيل. أخرج الماوس من الغرفة ، وفي الهواء الطلق ، احلق شعر الرأس جيدا بين الأذنين من مستوى العين إلى أعلى منطقة الرقبة باستخدام أداة تشذيب الشعر.
   ملاحظة: يعتمد تركيز الأيزوفلوران المستخدم على حجم غرفة الحث. لذلك ، بالنسبة للغرف الأصغر ، يمكن استخدام 3-4٪ من الأيزوفلوران للحث على التخدير بشكل فعال ، بينما تتطلب الغرف الأكبر ما يصل إلى 5٪.
3. انقل الماوس إلى مخروط الأنف لمحطة الجراحة التجسيمية للتخدير (1.5-2٪ للصيانة أثناء الجراحة) ، وقم بتثبيت رأسه باستخدام قضبان الأذن ، واحتفظ بالماوس على وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة جسمه دافئة.
4. قم بتليين كلتا العينين بمرهم العين. حقن 100 ميكرولتر من 0.25٪ بوبيفاكائين (لتوفير تسكين موضعي للفأر يستمر من 8 إلى 12 ساعة) و 100 ميكرولتر من 4 مجم / مل ديكساميثازون (لتقليل الالتهاب الذي قد ينتج عن إجراء الجراحة) تحت الجلد في موقع الشق. اسمح للماوس بالجلوس لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
5. نظف الرأس المحلوق بثلاث مسحات متناوبة من البيتادين و 70٪ كحول. باستخدام شفرة جراحية أو مقص جراحي ، قم بعمل شق في خط الوسط لفروة الرأس يمتد من الجزء الخلفي من منطقة الجمجمة بين الأذنين إلى المنطقة الأمامية بين العينين. يتم قطع الجلد المتبقي لفضح الجمجمة.
6. نظف النسيج الضام الموجود بين فروة الرأس والجمجمة السفلية بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين (H₂{O₂) وقم بتوطين منطقة الدماغ المراد تصويرها بإحداثيات التجسيم.
   ملاحظة: غالبا ما يكون هناك بعض النزيف (الخطوة 1.5) من الشق الموجود على سطح الجمجمة. عادة ما يتم حل هذا النزيف من تلقاء نفسه في غضون 3-5 دقائق. يساعد التنظيف بالبيروكسيد. يلاحظ أيضا أن العلاج السابق بالبوبيفاكائين (الخطوة 1.4) يحد من كمية النزيف خلال هذا الوقت.

2. جراحة زرع نافذة الجمجمة بالفأر

1. قم بحفر فتحة دائرية ~ 4 مم في الجمجمة باستخدام مثقاب الأسنان (قطر الطرف 0.7 مم) وقم بإزالة هذا الجزء من الجمجمة بعناية باستخدام ملقط مدبب. لتصوير القشرة الحسية الجسدية للفئران البالغة من العمر 6-8 أسابيع ، حدد موقع مركز حج القحف عند -2.5 خلفي و ± 2.0 جانبيا إلى بريجما. أثناء الحفر ، قم بترطيب الجمجمة بانتظام بمحلول ملحي معقم ومسحات قطنية لتبريد الدماغ وتنظيف بقايا العظام وتنعيم عظم الجمجمة لإزالتها في نهاية المطاف.
   ملاحظة : تختلف إحداثيات حج القحف حسب المنطقة التي تثير الاهتمام وعمر الفئران.
2. بعد إزالة الجمجمة ، ضع غطاء زجاجا صغيرا بحذر (الحجم # 0 بسمك 0.1 ± 0.02 مم) مبلل بالمحلول الملحي في حج القحف. جفف المحلول الملحي الزائد باستخدام منديل معقم.
3. باستخدام قضيب مدبب (مثل طرف الماصة أو الطرف المدبب لعصا مسحة قطنية خشبية مكسورة) ، ضع غراء سيانواكريليت حول النافذة واتركه يلتصق بالدماغ والجمجمة. ضع الغراء التمهيدي على بقية الجمجمة وقم بمعالجته بضوء معالجة لمدة 20-40 ثانية. قم بإعداد بئر حول النافذة بالغراء النهائي ومعالجته بضوء معالجة 20-40 ثانية.
4. قم بلصق لوحة رأس صغيرة على الجمجمة في نصف الكرة الأرضية المقابل لحج القحف أولا باستخدام الغراء التمهيدي كأساس ثم بالغراء النهائي. عالج كلاهما بضوء المعالجة لمدة 20-40 ثانية لكل منهما.
   ملاحظة: الغرز غير ضرورية إذا كانت الجمجمة مغطاة بالغراء أثناء هذا الإجراء.

3. رعاية ما بعد الجراحة

1. اسمح للفأر بالاستيقاظ بدون تخدير (التعافي على وسادة التدفئة يقصر وقت الشفاء) وإعادته إلى قفص منزله بمجرد استيقاظه التام. حقن جرعة واحدة تحت الجلد من البوبرينورفين SR (0.5 مجم / كغ) كمسكن بعد الجراحة تكفي لمدة 72 ساعة.
2. لتسهيل الشفاء الصحي من الجراحة ، زود الفأر بالطعام شديد النعومة ، مثل الطعام الصلب العادي المنقوع في الماء لتليينه أو الطعام على شكل هلام.
   ملاحظة: يكفي توفير الطعام اللين لمرة واحدة بعد الجراحة مباشرة.
3. راقب الفأر يوميا للتأكد من صحته والتعافي السليم لأول 72 ساعة من إجراء الجراحة. بعد ذلك ، سيتم إجراء التصوير من جراحة زرع النافذة في وقت مبكر يصل إلى أسبوعين.
   ملاحظة: إذا تم إجراؤها بشكل جيد ، تتعافى الفئران جيدا لتظهر سلوكيات متنقلة طبيعية ، واستكشاف كاف للقفص ، وترطيب جيد ، وزيادة مستقرة في الوزن ، وتفاعلات واسعة النطاق مع الفئران الأخرى في القفص وعناصر أخرى في القفص. يتم القتل الرحيم للفئران التي تظهر عليها الخمول والجفاف وفقدان الوزن بنسبة تزيد عن 10٪ بعد الجراحة وإزالتها من الدراسة.

4. رسم خرائط الدماغ ثنائي الفوتون للتصوير الأولي

1. تخدير الفأر (إيزوفلوران ، 5 ٪ تحريض و 1.5 ٪ صيانة). قم بتثبيت الرأس باستخدام مسامير لتركيب الصفيحة الأمامية على مرحلة المجهر ثنائي الفوتون ، ويتم الحفاظ عليها على لوحة تسخين عند 35 درجة مئوية. قم بحقن 100 ميكرولتر من صبغة الأوعية الدموية داخل الصفاق مثل Rhodamine B (2 مجم / مل).
   ملاحظة: يمكن أيضا إجراء التصوير في الفئران المستيقظة بدون تخدير. ومع ذلك ، تشير الدراسات الحديثة إلى أن التخدير يؤثر على ديناميكيات مراقبة الخلايا الدبقية الدقيقة. يزيد تثبيت الرأس للتصوير ثنائي الفوتون في الفئران المستيقظة من التوتر حتى أثناء التصوير المزمن لمدة 25 يوما على الأقل.
2. نظف سطح نافذة الجمجمة برفق باستخدام قطعة قطن مغموسة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع بضع قطرات من الماء أو المحلول الملحي على نافذة الجمجمة وقم بخفض العدسة الموضوعية في المحلول لأن الهدف هو عدسة الغمر.
3. ارسم يدويا خريطة خشنة للدلالة على معالم الأوعية الدموية الرئيسية في دفتر ملاحظات مختبر أثناء النظر من خلال العدسة عن طريق التألق العرضي. استخدم هذا الرسم لتحديد المناطق المحددة أثناء التصوير ثنائي الفوتون. بدلا من ذلك ، التقط صورا للأوعية الدموية إما من خلال كاميرا مثبتة على المجهر أو من خلال كاميرا أو هاتف محمول باليد.
   ملاحظة: تهدف هذه الصور والصور المرسومة يدويا إلى تسهيل إعادة النظر في نفس المناطق الواسعة تحت المجهر قبل تصوير الفوتونين. هذه ليست رسم خرائط دقيقة للصور.
4. تحت تصوير الفوتون ، اجمع صورا لخلايا والأوعية الفلورية حسب الحاجة. قم بتدوين ملاحظات دقيقة مع الإحداثيات المناسبة للتأكد من إمكانية إعادة النظر في المناطق الدقيقة للتصوير اللاحق. اجمع العديد من مجالات الرؤية في جلسة التصوير الأولية هذه ، على سبيل المثال الحصول على صور z-stack كل 1-2 ميكرومتر من خلال حجم الأنسجة.
   ملاحظة: أثناء جمع الصور بواسطة فوتونين ، يتم استخدام معالم الأوعية الدموية لرسم الخرائط الخشنة. إذا كانت هناك حاجة إلى رسم خرائط دقيقة ، يتم استخدام التشعبات المسماة YFP من الفئران Thy1-YFP.
   1. استخدم هذه المعلمات الموصى بها للتصوير: الطول الموجي 880-900 نانومتر هو الأمثل. وبالنسبة لإثارة GFP و/أو dsRed/Rhodamine، تستعمل مرآة ثنائية اللون بحجم 565 نانومتر مع مرشحات انبعاث 525/50 نانومتر (قناة خضراء) و620/60 نانومتر (قناة حمراء)؛ لفصل GFP و YFP ، يتم استخدام مرآة ثنائية اللون 509 نانومتر مع مرشحات انبعاث 500/15 و 537/26 نانومتر ؛ يتم الحفاظ على الطاقة في الدماغ عند 25 ميغاواط أو أقل ؛ دقة الصورة 1024 × 1024 بكسل ، ومجال الرؤية الذي تم التقاطه بهدف 25X 0.9 NA بعامل تكبير 1.5X هو 295.24 × 295.24 ميكرومتر.
5. في نهاية التصوير ، أخرج الماوس عن المسرح ، واتركه يستيقظ من التخدير ويعود إلى قفصه المنزلي حتى جلسة تصوير مستقبلية.

5. التصوير ثنائي الفوتون وإعادة التصوير

1. لجلسات التصوير اللاحقة المستقبلية ، والتي يمكن أن تكون في أي مكان من بضع ساعات إلى أشهر بعد جلسة التصوير الأولية ، تخدير الفأر (Isoflurane ، تحريض 5٪ و 1.5٪ صيانة) ، وتركيب على المجهر ثنائي الفوتون ، والحفاظ على لوحة التسخين وإعادة حقن 100 ميكرولتر من صبغة الأوعية الدموية مثل Rhodamine B (2 مجم / مل).
2. افتح الصور التي تم الحصول عليها مسبقا في ImageJ ، وباستخدام هذه الصور بالإضافة إلى الملاحظات من الجلسة السابقة ، حدد المناطق التي تم تصويرها مسبقا وأعد تصويرها بعناية.
3. كرر هذا طالما أن نافذة التصوير واضحة أو ضرورية لمدى الدراسة.

المواد

<فئة الشكل = نمط "الجدول" = "العرض: 764pt;'>< td style='العرض:139pt;'> < نمط td = 'العرض: 239pt;'>Fine Science Tools< نمط td = 'العرض: 186pt ؛' >66040094< td style='width:139pt;'>

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
غراء سيانواكريليت (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED علاج ضوء النظام	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
مثقاب	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Primer Glue)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1