تصوير تشتت رامان المحفز بلونين لأنسجة دماغ الفئران

الملخص

Espinoza، R. ، et al. في الوقت الحقيقي ، بلونين يحفز تصوير تشتت رامان لدماغ الفأر لتشخيص الأنسجة. J. Vis. Exp.يوضح الفيديو تصوير بلونين محفز لتشتت رامان (SRS) لأقسام أنسجة دماغ الفئران. يتم توجيه حزمتين ليزريتين متزامنتين إلى قسم الأنسجة لإثارة الاهتزازات الجزيئية ، مما يؤدي إلى تغيير نسبي في الشدة في الحزم. يتم الكشف عن الدهون والبروتينات في الأنسجة باستخدام أزواج تردد مميزة من أشعة الليزر. ثم يتم تعيين ألوان منفصلة للإشارات الناتجة ، مما يؤدي إلى إنشاء صورة بلونين تساعد في تحديد البروتينات والدهون في الأنسجة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. كشف إشارة SRS

1. {{TAG_20}TAG_21} {{}}
   ملاحظة:{ يتم استخدام EOM بمقدار 20 ميجاهرتز لتعديل سعة ستوكس. كما تمت مناقشته لاحقا ، يتم اشتقاق EOM من قطار نبض الليزر 80 ميجاهرتز ، وهو مطلوب للتعديل المتعامد. يمكن استعمال ترددات التشكيل الأخرى إذا تم إجراء SRS أحادي اللون أو فائق الطيف. في هذه الحالة ، يكون تزامن تردد التعديل مع تردد الليزر غير ضروري. يمكن استخدام مولد تردد مزود بمضخم طاقة للترددات الراديوية (RF) لتشغيل EOM. ونتيجة لذلك، يمكن تخطي الخطوات 1.1.1-1.4.
   1. ضع جهاز أخذ عينات الشعاع في مسار شعاع Stokes لالتقاط 10٪ من الحزمة وإرساله إلى الصمام الثنائي الضوئي السريع للكشف عن قطار النبض 80 ميجاهرتز.
      ملاحظة: يتم إرسال إشارة الصمام الثنائي الضوئي إلى مقسم تردد لتوليد إخراج TTL 20 ميجاهرتز. يتم إرسال هذا الإخراج أيضا إلى مخزن مؤقت fanout لنسخ الإخراج في أربعة مخرجات متطابقة 20 ميجاهرتز. يتم استخدام أحد المخرجات لتشغيل راسم الذبذبات.
   2. خذ أحد مخرجات المخزن المؤقت للمروحة وقم بتصفيته باستخدام مرشح ممر النطاق للحصول على موجة جيبية 20 ميجاهرتز. استخدم مخفف التردد اللاسلكي لضبط جهد الإخراج من الذروة إلى الذروة إلى ~ 500 مللي فولت.
   3. أرسل الإخراج الناتج إلى ناقل الحركة الطوري ، والذي يسمح بالضبط الدقيق لمرحلة التردد اللاسلكي بمصدر جهد. أرسل هذا الإخراج إلى مضخم طاقة RF وقم بتوصيل إخراج مكبر الصوت ب EOM.
   4. قم بفك حظر شعاع Stokes وقم بتحسين عمق تعديل EOM1 عن طريق وضع الصمام الثنائي الضوئي في مسار الحزمة. اضبط جهد EOM ولوحة ربع الموجة حتى يبدو عمق التعديل (نسبة الوادي إلى الذروة) مرضيا.
      ملاحظة: عند تعديل 20 ميجاهرتز (1/4 من معدل تكرار الليزر) ، من المتوقع حدوث نبضتين كل 50 نانوثانية.
2. التداخل الزمني
   ملاحظة: يتم تحقيق التداخل الزمني للمضخة وستوكس عن طريق تأخير أحد قطاري نبضات الليزر مع عاكس رجعي مثبت على مرحلة تأخير ( يوضح الشكل 1 تأخر ستوكس). تتم مراقبة التداخل الخشن باستخدام راسم الذبذبات ، ويتم مراقبة التداخل الدقيق بواسطة إشارة SRS. يمكن أيضا تحقيق التداخل الزمني الدقيق باستخدام الارتباط التلقائي إذا كان متاحا.
   1. ضع الصمام الثنائي الضوئي بعد المرآة ثنائية اللون للكشف عن شعاع الليزر. قم بحظر شعاع ستوكس أولا. قم بتكبير إحدى قمم نبض المضخة على راسم الذبذبات. ضع مؤشرا رأسيا لتحديد الموضع الزمني لهذه الذروة باستخدام راسم الذبذبات.
   2. قم بسد شعاع المضخة وفك حظر شعاع Stokes. قم بترجمة مرحلة التأخير لمطابقة موضع الذروة مؤقتا على راسم الذبذبات إلى الموضع المحدد في الخطوة السابقة. انظر الشكل 2 لعرض التداخل الزمني لحزمتين.
      1. (اختياري) إذا كانت ترجمة مرحلة التأخير غير كافية لمطابقة الحزمتين مؤقتا ، فقم بتحريك مرحلة التأخير إلى منتصف نطاق حركتها.
      2. احسب مسافة التأخير المطلوبة لمطابقة الحزمتين عن طريق أخذ الفرق الزمني بين الحزمتين وضرب الفرق في سرعة الضوء لإيجاد مقدار المسافة اللازمة لمطابقة الحزمتين مؤقتا.
      3. قم بإطالة مسار الحزمة للحزمة الأسرع أو تقصير مسار الحزمة الأبطأ لمطابقة التأخير الزمني تقريبا وفقا لذلك.
   3. قم بإعداد عينة شريحة مجهرية مع ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وشريط على الوجهين كمباعدة لتثبيت العينة بين الشريحة والغطاء.
   4. ضع العينة على المجهر بحيث يكون جانب الغطاء مواجها لهدف المجهر. قم بتغيير المجهر إلى إضاءة المجال الساطع وراقب العينة من العدسة. ابحث عن تركيز العينة عن طريق العثور أولا على التركيز البؤري في كل من الطبقة العلوية والسفلية من فقاعات الهواء في واجهة الشريط الزجاجي، ثم حرك التركيز البؤري ليكون بين طبقتي الشريط.
      ملاحظة : تأكد من حظر أشعة الليزر قبل النظر إلى العدسة العينية.
   5. اضبط خرج الشعاع القابل للضبط على 798 نانومتر. بناء على الإنتاجية البصرية للمكثف ، اضبط الطاقة الضوئية لتكون ~ 40 ميجاوات لكل من المضخة وحزم Stokes عند التركيز الموضوعي.
   6. افتح ScanImage في MATLAB (أو أي برنامج مسح آخر يتحكم في المجهر) وانقر على الزر المسمى FOCUS لبدء المسح.
      ملاحظة: سيتم مسح أشعة الليزر ضوئيا نقطيا من خلال العينة لإنشاء صورة. يتم إرسال خرج إشارة التردد المنخفض من الصمام الثنائي الضوئي (< 100 كيلو هرتز) مباشرة إلى القناة 1 من بطاقة الحصول على البيانات (يشار إليها باسم قناة التيار المستمر). يتم إرسال خرج التردد العالي (>100 كيلو هرتز) من الصمام الثنائي الضوئي إلى مضخم القفل ، ويتم إرسال الإخراج X لإشارة مكبر الصوت القفل إلى القناة 2 من بطاقة الحصول على البيانات (يشار إليها باسم قناة التيار المتردد).
   7. اضبط مرآة التوجيه قبل الماسح الضوئي galvo لتوسيط إشارة التيار المستمر على شاشة القناة 1. حرك مرحلة التأخير الآلية وراقب عن كثب إخراج القفل الموضح على شاشة القناة 2 (أي قناة التيار المتردد).
      ملاحظة: عندما تتزامن المضخة وستوكس في الوقت المناسب ، ستظهر إشارة على قناة التيار المتردد. من المفيد ضبط مقياس ألوان قناة التيار المتردد لعرض تغيير الشدة الصغير.
   8. قم بزيادة شدة إشارة التيار المتردد إلى أقصى حد عن طريق ضبط تأخير الوقت بدقة. اضبط المرآة ثنائية اللون لتوسيط إشارة SRS على قناة التيار المتردد (مع الحفاظ على قناة التيار المستمر في المنتصف). اضبط طور مضخم القفل لزيادة الإشارة إلى أقصى حد. انظر الشكل 3 للحصول على إشارة مرضية.

3. تحسين الدقة الطيفية

ملاحظة: يجب أن يكون للمضخة وحزم ستوكس التي تصل إلى العينة نفس القدر من تشتت تأخير المجموعة (GDD) لزيادة الدقة الطيفية. يعتمد التشتت بشكل كبير على الإعداد التجريبي. يستخدم الإعداد التجريبي الموصوف هنا نبضات الفيمتو ثانية عند 1,040 نانومتر و 800 نانومتر مثل ستوكس ومضخة ، على التوالي. تستخدم قضبان زجاج الصوان الكثيفة (H-ZF52A) كوسيط لتمديد النبض.

1. أدخل 48 سم من قضيب زجاجي عالي التشتت (H-ZF52A أو زجاج صوان كثيف مكافئ) في مسار الشعاع 800 نانومتر. قم بتقدير GDD باستخدام المعادلة (1):

   

   } ملاحظة: يمكن العثور على GVD لمواد زجاجية مختلفة بأطوال موجية مختلفة من مورد قاعدة بيانات معامل الانكسار. على سبيل المثال ، يحتوي H-ZF52A على GVD يبلغ 220.40 fs ² / مم عند 800 نانومتر. إجمالي GDD هو 105792 fs².

2. احسب عدد السنتيمترات من قضيب الزجاج المشتت المطلوب إضافته إلى مسار الشعاع 1,040 نانومتر ليتناسب مع GDD للمضخة. أدخل الطول المناسب لقضبان الزجاج المشتتة في مسار الشعاع 1,040 نانومتر لتتناسب تقريبا مع GDD لشعاع 800 نانومتر. لاحظ أن إضافة قضبان زجاجية ستغير التداخل الزمني للحزمتين ، وقد يكون من الضروري تعديل التأخير.
3. معايرة الدقة الطيفية
   1. قم بعمل عينة من شريحة المجهر باستخدام DMSO. ضع الشريحة على المجهر وتحقق من قوة الحزم الخارجة من مكثف المجهر. اضبط الطاقة وفقا لذلك للحصول على ~ 40 ميجاوات لكل منها عند تركيز العينة.
   2. افتح ScanImage من MATLAB. ابحث عن إشارة SRS القصوى عن طريق المسح الضوئي من خلال مرحلة التأخير ، والتي تتوافق مع 2,913 سم ^-1 ذروة رامان من DMSO. تقدير موضع المرحلة بناء على موضع المرحلة السابقة مع زيادة طول المسار البصري بسبب إدخال القضبان. أعد محاذاة التداخل المكاني للحزمة بسبب الانحراف الصغير للحزمة عند إضافة قضبان زجاجية.
   3. احفظ مسح SRS فائق الطيف عن طريق التقاط سلسلة من صور SRS بالتتابع أثناء تحريك المرحلة الآلية.
      ملاحظة: يغطي نطاق التأخير قمتين من قمم رامان ، تتوافق مع 2,913 سم ^{-1 -1} قمم رامان من DMSO ، على التوالي. لوحظ هذين الانتقالين عند استخدام مضخة 800 نانومتر وليزر ستوكس 1,040 نانومتر.
   4. ارسم أطياف SRS لحل DMSO باستخدام ImageJ أو MATLAB. قم بتركيب الذروة الكبيرة DMSO 2,913 cm^-1 إلى دالة Gaussian أو Lorentzian في MATLAB لحساب العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) للذروة.
      ملاحظة: النتائج التمثيلية معروضة في الشكل 4. إذا كانت هناك قمة عريضة واحدة فقط ، فهذا يعني إما أن الدقة الطيفية ضعيفة جدا بحيث لا يمكن التمييز بين القمتين وهناك حاجة إلى المزيد من القضبان الزجاجية ، أو أن النطاق الممسوح ضوئيا كان صغيرا جدا لاكتشاف الذروة الثانية. عادة ما تكون الدقة الطيفية المقبولة DMSO ~ 20-25 سم ^-1 عند استخدام قضيب زجاجي بطول >60 سم. غالبا ما تستخدم الدقة المنخفضة لتصوير الأنسجة لاستبدال إشارات أعلى بنبضات أقصر.
4. (اختياري) استخدم الارتباط التلقائي أو FROG (البوابات البصرية التي تم حلها بالتردد) لتحديد مدة النبضة لكل ذراع لحساب مقدار GDD بالضبط وطول القضبان اللازمة لمطابقة GDD بين المضخة و Stokes.
5. كرر الخطوات 3.3.2-3.3.4 لأطوال قضبان مختلفة على شعاع ستوكس للعثور على الدقة الطيفية المثلى ، مما يعني أنه تم العثور على أفضل تطابق GDD تجريبيا. استخدم مجموعات متعددة من قضبان الزجاج تختلف في الطول لتحقيق الدقة الطيفية المثلى.

4. توصيف الإشارة إلى ضوضاء (SNR)

1. تأكد من تنفيذ الخطوة 4.2 بعد المحاذاة المكانية والزمانية الكاملة.
2. احصل على صورة SRS تتوافق مع 2,913 سم ^-1 رامان الذروة من DMSO. افتح الصورة في ImageJ وحدد مساحة صغيرة في وسط الإطار. استخدم الدالة قياس لحساب المتوسط والانحراف المعياري للقيم في المنطقة المحددة.

3. اقسم القيمة المتوسطة للمنطقة المحددة على الانحراف المعياري للعثور على قيمة SNR، كما هو الحال في المعادل (2).

   

   ملاحظة: SNR جيد للنظام (مع ثابت وقت قفل يبلغ 4 ميكرو ثانية) باستخدام DMSO عند 40 ميجاوات / 40 ميجاوات عند التركيز لكلا الذراعين هو >800. يمكن استخدام تركيزات أقل من DMSO أو طاقة أقل لتقدير أكثر دقة ل SNR إذا كانت بطاقة الحصول على البيانات ذات عمق بت محدود.

4. إذا كان SNR منخفضا جدا ، فأعد محاذاة نبضات الليزر لتحسين التداخل المكاني ، والتداخل الزمني ، ومطابقة حجم الحزمة / الموازاة ، و / أو مطابقة التشتت. بالنسبة لهدف ذو طوق تصحيح الانحراف ، قم بتحسين الإشارة عن طريق ضبط طوق التصحيح.

5. معايرة محور التردد

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لربط موضع مرحلة التأخير بانتقال رامان الممسوح ضوئيا. مطلوب اختيار دقيق للمذيبات لتوليد "حاكم رامان" مناسب. DMSO هو مذيب فعال لروابط CH لأنه يحتوي على قمتين حادتين من رامان عند 2,913 سم ^{-1 -1}.

1. احفظ مسحا فائقا طيفيا مع نطاق مرحلة التأخير الذي يغطي 2,913 سم ^{-1 -1{{TAG_501 TAG_502}} قمم رامان من DMSO. احفظ مواضع المرحلة المقابلة لمجموعة البيانات الفائقة الطيفية.}
   ملاحظة: يتوافق الحد الأقصى العالمي لذروة الطيف مع DMSO 2,913 سم التحول الرامان والذروة القصوى الثانية تتوافق مع DMSO 2,994 سم ^-1 تحول رامان.
2. قم بإجراء الانحدار الخطي لمواضع المرحلة ونزاحات رامان عند 2,913 سم ^-1 و 2,994 سم ^-1. باستخدام معادلة الانحدار الخطي التي تربط موضع المرحلة بإزاحة رامان ، قم بتحويل مواضع التأخير إلى ترددات رامان المقابلة.

6. التعديل المتعامد والتصوير ثنائي اللون

ملاحظة: خطوة التعديل المتعامد ضرورية فقط عند الحاجة إلى تصوير ثنائي اللون في الوقت الفعلي. يظهر الرسم التخطيطي لهذا المخطط في الشكل 5 . يستخدم التعديل المتعامد زوجا من EOMs مدفوعا بربع تردد الليزر (20 ميجاهرتز لليزر 80 ميجاهرتز) مع تحول طور 90 درجة بين الاثنين. يمكن تخطي خطوة التعديل المتعامد هذه لتصوير SRS أحادي اللون أو تصوير SRS الفائق الطيفي.

1. تعديل EOM1
   1. تركيب مقسم شعاع مستقطب (PBS2) ولوحة ربع موجة (QWP2) وEOM ثان (EOM2) في مسار حزمة Stokes بعد EOM الأول. افصل دخل الإشارة إلى EOM2. قم بتوصيل إدخال الإشارة ب EOM1 وقم بتشغيله.
   2. قم بتعديل حزمة ستوكس (الثابتة عند 1,040 نانومتر) عند 20 ميجاهرتز (f₀/4) عن طريق إرسال الحزمة عبر أول EOM. اضبط إمالة وموضع EOM1 للتأكد من أن الشعاع يضرب بشكل مستقيم ويتركز من خلال بلورة EOM.
   3. راقب عمق التعديل من خلال مراقبة كلا الاستقطابين الخارجين من PBS1 باستخدام صمامين ثنائيين ضوئيين وعرض التعديل على راسم الذبذبات.
   4. اضبط جهد QWP1 و EOM1 وطور مدخل 20 ميجاهرتز (باستخدام مبدل الطور) لتحسين عمق تعديل الحزمة المرسلة ليكون قريبا من 100٪. انظر الشكل 2B للحصول على توضيح لعمق التعديل الجيد.
2. تعديل EOM2
   1. افصل EOM1 وقم بتوصيل EOM2.
   2. أرسل خرج الجهد العالي لمكبر الصوت الثاني عند 20 ميجاهرتز إلى EOM2. اضبط إمالة وموضع EOM2 للتأكد من أن الشعاع يضرب بشكل مستقيم ويتركز من خلال بلورة EOM.
   3. مرة أخرى ، راقب عمق التعديل من خلال النظر إلى كلا الاستقطابين الخارجين من PBS2 باستخدام راسم الذبذبات. اضبط جهد QWP2 و EOM2 ومبدل الطور حسب الحاجة لتحقيق ما يقرب من 100٪ تعديل لكلا الاستقطابين.
   4. تأكد من أن تعديل قطار النبض له تحول طور 90 درجة من التعديل الأول.
      ملاحظة: إذا لم يكن قطار نبض المضخة متعامدا بزاوية 90 درجة ، فسيكون الحديث المتبادل بين القناتين مشكلة.
   5. اختبر تعامد التعديل عن طريق تشغيل وتوصيل كل من EOM1 و EOM2. راقب كلا الاستقطابين اللذين يتم تقسيمهما بواسطة PBS2 باستخدام راسم الذبذبات. أعد تحسين EOM1 و EOM2 بشكل فردي إذا كان قطار النبض بعد PBS الثاني لا يشبه الشكل 2C.
   6. قم بتركيب بلورة كوارتز ثنائية الانكسار مقاس 20 مم (BRC) ولوحة نصف موجة (HWP) في اتجاه مجرى EOM2. قم بتوصيل كل من EOM في وقت واحد وراقب قطار النبض بحيث يشبه الشكل 2D.
      ملاحظة: بالنسبة للزقزقة المستخدمة في هذه التجربة ، يؤدي BRC 20 مم إلى تأخير زمني يتوافق مع 80 سم ^-1 تحول رامان. قد تكون هناك حاجة إلى طول BRC مختلف إذا تم استخدام زقزقة مختلفة.
3. معايرة
   1. معايرة النظام باستخدام DMSO عن طريق اكتشاف الإشارات من مخرج قناة مضخم القفل X وY (المرسلة إلى القناتين 2 و3 من بطاقة الحصول على البيانات).
   2. تحقق مما إذا كانت الإشارات الناتجة عن 2,913 سم ^-1 الذروة من الاستقطاب الأسرع وأنه من الاستقطاب الأبطأ تقترب من 90 درجة خارج الطور على مضخم القفل. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط محاذاة EOM حتى تقترب الإشارتان من 90 درجة خارج الطور.
   3. بمجرد اكتمال المعايرة ، أوجد موضع التأخير الذي يفحص انتقال البروتين عند 2,930 سم ^-1 لأحد الحزم المتعامدة. تأكد من أن الاستقطاب الآخر يفحص انتقال الدهون البالغ 2,850 سم ^-1 .

7. تصوير SRS في وضع Epi

ملاحظة: في مخطط التصوير في وضع الإرسال ، يركز الهدف الليزر في العينة ، ثم تقوم عدسة المكثف بتوجيه الشعاع المرسل إلى الصمام الثنائي الضوئي للكشف عن القفل. في مخطط التصوير في وضع epi ، يتم استخلاص الضوء الذي يتم تشتته وإزالة الاستقطاب بواسطة العينة بواسطة هدف التركيز وعزله باستخدام مقسم شعاع مستقطب. يتم إرسال الفوتونات المعزولة والمبعثرة إلى الصمام الثنائي الضوئي من خلال زوج من عدسات الترحيل للكشف عن القفل. الشكل 6 يصور مخطط التصوير في وضع epi-mode.

1. قم بتثبيت HWP قبل دخول الحزمة إلى المجهر لتغيير استقطاب الحزمة التي تدخل المجهر. ضع PBS فوق الهدف للسماح للحزمة المنعكسة الخلفية غير المستقطبة بالوصول إلى الكاشف.
2. استخدم زوجا من العدسات تتكون من عدسة أكرومات مقاس 75 مم وعدسة شبه كروية مقاس 30 مم لترحيل الفوتونات المتناثرة من الفتحة الخلفية للهدف إلى الكاشف الضوئي. قم بتركيب الكاشف لتجميع الضوء المتناثر الخلفي الموجه بواسطة PBS. قم بتثبيت مرشح لمنع الحزمة المعدلة من دخول الكاشف.
3. ضع عينة الأنسجة تحت الهدف. نظرا لأن المكثف غير ضروري للتصوير في وضع epi ، فقم بإزالته إذا كانت هناك حاجة إلى مساحة أكبر.
4. التصوير
   1. حجب الشعاع بمصراع. تسليط مصدر ضوء أبيض على العينة من الجانب ؛ واستخدم Brightfield للعثور على التركيز الموضوعي.
   2. قم بفك حظر كلا الحزم واستخدم مواضع التأخير المعايرة مسبقا للحصول على صور SRS للدهون والبروتين من الأنسجة من مخرجي مكبر الصوت القفل.
   3. اضبط كسب القفل وعامل سلة البكسل للحصول على صور عالية الجودة.

8. تلطيخ اللون الكاذب

1. افتح مكدس الصور باستخدام ImageJ.
2. اسحب الصورتين اللتين تتوافقان مع أنواع الدهون (2,850 سم^-1) والبروتين (2,930 سم^{-1{{TAG_838 TAG_839}}) عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الصورة والنقر على .}
3. أعد تسمية الصورة الدهنية إلى الدهون وصورة البروتين إلى البروتينات.
4. انتقل إلى العملية | حاسبة الصور وأداء البروتينات .
5. اجمع الصور بالانتقال إلى صورة | اللون | دمج القنوات، إعداد إلى الأخضر و {{TAG_915}TAG_916} إلى أزرق. افتح أداة قنوات الصور ( صورة | اللون | أداة القنوات) وضبط السطوع والتباين ( الصورة | ضبط | السطوع / التباين ).
6. اضبط السطوع والتباين لكل قناة باستخدام الأداة . بالنسبة لقناة الدهون، اضبط التباين حتى تظهر المعالم الخلوية داكنة. بالنسبة لقناة البروتين، اضبط التباين حتى تظهر المعالم الخلوية باللون الأزرق. قم بتحويل صورة القناة المدمجة باللون الأخضر / الأزرق إلى صورة RGB بالانتقال إلى صورة | النوع | RGB Color. تصدير هذه الصورة بواسطة ملف | حفظ باسم | Tiff.
   ملاحظة : بالنسبة لتلوين H & E الخاطئ ، يظهر نظام الألوان السيتوبلازم الوردي ، بينما تكون النوى زرقاء أرجوانية داكنة.
7. قم بتنزيل البرنامج النصي HE.m MATLAB من مورد البرنامج النصي الخاطئ لتلوين H&E في جدول المواد.
8. قم بتشغيل البرنامج النصي HE.m في MATLAB. حدد صورة RGB المصدرة من الخطوة السابقة لإنشاء صورة مصطنعة ب H & E.
9. (اختياري) قم بتطبيع كثافة الصورة لتصوير مجال الرؤية الكبير لأن الصورة تبدو أغمق في المحيط منها في المنتصف.
   1. لإجراء تطبيع الحقل للصور، قم بحساب متوسط أكبر عدد ممكن من الصور. بعد ذلك ، قم بإزالة ميزات الكثافة باستخدام ImageJ ( العملية | الفلاتر | ضبابية غاوسية | نصف القطر = 50 ).
   2. قم بقياس الحد الأقصى لكثافة الصورة غير الواضحة (Ctrl+M). اقسم الصورة غير الواضحة على الحد الأقصى للكثافة ( العملية | الرياضيات | قسم). قسم صورة SRS الأولية على الصورة غير الواضحة ( العملية | صورة | آلة حاسبة).

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root='1' data-sheets-baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات <نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 100 مم العدسة اللونية < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>THORLABS< td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>AC254-100-B< td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كسر الكلمة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ >النطاق العريض ، 650 - 1،050 نانومتر ، البعد البؤري للعدسة اللونية ، نمط 100 مم < tr = 'الارتفاع: 20 بكسل ؛' >20 MHz band bandpass filterMinicircuitsBBP-21.4+Composite LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω200 mm Achromatic LensTHORLABSAC254-200-Bالنطاق العريض، 650 - 1,050 نانومتر، البعد البؤري للعدسة اللونية، 200 ممachromatic Half WaveplateUnion OpticWPA2210-650-1100-M25.4Broadband نصف لوحة موجية< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>achromatic Quarter WaveplateUnion OpticWPA4210-650-1100-M25.4Broadband Broadband ربع الموجة < td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Beam SamplerTHORLABSBSN1110:90 Plate Beamsplitterمرآة ثنائية اللون < td style = 'overflow: مخفي ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ vertical-align: bottom ؛ '>THORLABS< td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom;'>DMSP1000 يمكن استخدام ثنائيات اللون الأخرى ذات الطول الموجي المركزي حوالي 1,000 نانومتر.DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد)Sigma Aldrich472301Molation for Calibrat of Raman shift. يمكن استخدام مذيبات أخرى ذات قمم رامان معروفة.Electrooptic Amplitude ModulatorTHORLABSEO-AM-NR-C1False H&E Staining ScriptMatlab https://github.com/TheFuGroup/HE_StainingFanout BufferPRL-414BPulse Research LabFast PhotodiodeTHORLABSDET10A2< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Si Detector, 1 ns Rise TimeFrequency DividerPRL-220APulse Research LabTTL Freq. Divider (f / 2, f / 4, f / 8, f / 16), ل توليد 20 ميجا هرتز من إخراج الليزر.Highly Dispersive Glass RodsUnion OpticCYLROD01عدسة قضيب H-ZF52A عالية التشتت 120 مم، قضيب SF11 نمط العدسة 100 مم < نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> البصيرة DS + < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>Newport < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom;'> Lock-in AmplifierLiquid InstrumentsMoku Lab< td style = 'overflow: hidden ؛ boardding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> قفل مكبر للصوت لاستخراج إشارة SRS من الصمام الثنائي الضوئي. يمكن أيضا استخدام أداة Zurich Instrument HF2LI أو أداة مماثلة.MirrorsTHORLABSBB05-E03-10Broadband Tعازل Mirror, 750 - 1,100 nm. يمكن أيضا استخدام المرايا الفضية.Motorized Delay StageZaberX-DMQ12P-DE52Oil Immersion CondensorNikonCSC10031.4 NA. يمكن استخدام مكثفات أخرى مع NA>1.2.OscilloscopeTektronixTDS7054 أي راسم الذبذبات الآخر مع 400 ميجاهرتز النطاق الترددي أو أعلى يجب أن يعمل.Phase ShifterSigaTekSF50A2for change phase of modulation frequency< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>PhotodiodeHamamatsu CorpS3994-01silicon PIN diode with large (10 × 10 cm2). يمكن استخدام الثنائيات الأخرى ذات المساحة الكبيرة والسعة المنخفضة.Polarizing Beam SplitterUnion OpticPBS9025-620-1000Broadband Polarizing beamsplitterRefactive Index Database refractiveindex.info< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Retro-reflectorEdmund Optics34-408BBAR Right Angle Prism. يمكن استخدام مناشير أخرى أو عاكسات رجعية.RF Power AmplifierMinicircuitsZHL-1-2W +Gain Block, 5-500 MHz, 50 Ω<نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> مسح المرايا < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛'>Cambridge Technologies < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛'>6215H < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>استخدمنا مجموعة مرآة 5 مم مع طلاء فضي ScanImageVidrioScanImage Basicبرنامج التحكم في المجهر بالمسح الضوئي بالليزرShortpass FilterTHORLABSFESH1000Up-TablescopeNikonEclipse FN1Water Immersion ObjectiveOlympusXLPLN25XWMP2 the multiphoton 25X Objective has NA 1.05. يمكن استخدام أهداف أخرى مماثلة.