التصوير المجهري متحد البؤر للأشجار المتغصنة السليمة ومورفولوجيا العمود الفقري في دماغ الفأر الذي تم تطهيره

الملخص

المصدر: Pekarek, B. T., et. al., تصوير وقياس التشعبات العصبية السليمة عبر CLARITY Tissue Clearing. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح إعداد وتصوير وتحليل دماغ الفأر الذي تم تطهيره لفحص العرش الشجيرية ومورفولوجيا العمود الفقري وتوزيع الخلايا العصبية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وتقنيات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المناسبة.

1. تحضير وتركيب الأنسجة التي تم تطهيرها

1. } بعد انتهاء تنظيف العينة وتبدو واضحة بما فيه الكفاية ، اغسلها في PBS طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. استبدل PBS ب PBS الطازج قدر الإمكان. هذه الخطوة ضرورية لإزالة SDS المتبقية التي يمكن أن تشكل رواسب في خطوات لاحقة.
2. بعد الغسيل النهائي في PBS ، اغسل المنديل لمدة 5 دقائق في ماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة ثلاث مرات. ستصبح الأنسجة معتمة في هذه الخطوة وقد تتوسع.
3. احتضان الأنسجة في محلول مطابقة معامل الانكسار (انظر الجدول 1 ) لمدة 4 ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة. الشكل 1 ب يظهر قطعة من الأنسجة التي تم تطهيرها بعد الحضانة في محلول مطابقة معامل الانكسار.
4. أثناء حضانة الأنسجة في محلول مطابقة معامل الانكسار ، قم ببناء غرفة سكن مناسبة لتصوير العينة إذا لزم الأمر.
5. إنشاء غرفة تصوير لعينات / شرائح الأنسجة الصغيرة
   1. باستخدام شريحة زجاجية كقاعدة للتركيب ، ضع فواصل مطاطية أو بلاستيكية ومثبتة بالغراء الفائق. إذا لم تكن الفواصل مسبقة الصنع متوفرة ، فاستخدم حلقات بلاستيكية مصنوعة من مقاطع عرضية للأنبوب المخروطي.
   2. تأكد من تثبيت هذه القطع على الشريحة الزجاجية دون أي ثقوب ( الشكل 1C).
   3. ضع الأنسجة التي تم تطهيرها في حجرة التثبيت المملوءة مسبقا بمحلول مطابقة معامل الانكسار.
   4. قم بتركيب المنديل بإحكام عن طريق وضع غطاء زجاجي في الأعلى وإغلاقه بطلاء الأظافر.
   5. قم بتصوير هذا النسيج عن طريق إضافة قطرة من معامل الانكسار المطابق لمحلول التثبيت مباشرة فوق الزجاج.
6. غرفة تصوير الأنسجة الكبيرة
   1. قم ببناء هذه الغرفة إذا كان سمك الأنسجة أكبر من 5 مم (مناسب للأدمغة الكاملة أو نصفي الكرة الأرضية).
   2. باستخدام طبق زجاجي مقاس 10 سم بجدار مرتفع ، ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل في المنتصف ، مع التأكد من أن قطر المخروطي كبير بما يكفي لقبول برميل العدسة الشيئية المستخدمة.
   3. اصنع 3٪ من الاغاروز في الماء واسكبه في الفراغ بين الطبق الزجاجي والأنبوب المخروطي ، واتركه ليبرد لمدة ساعة واحدة ( الشكل 1D ). سيشكل هذا حلقة من الاغاروز الصلب ( الشكل 1E).
   4. قم بلصق الأنسجة بإحكام في قاع الغرفة باستخدام الغراء الفائق واملأ الغرفة بمحلول مطابقة معامل الانكسار. ضع الغراء للالتصاق بالأنسجة على منطقة لن يتم تصويرها للسماح باستصلاح الأنسجة من الطبق دون الإضرار بمناطق الاهتمام.
      ملاحظة: هذا المستحضر حساس للوقت ، حيث قد تبدأ وسائط معامل الانكسار في البلمرة ما لم يتم حفظها من الهواء وتخزينها عند 4 درجات مئوية.

2. تصوير عينات الأنسجة التي تم تطهيرها

1. احصل على الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر يناسب هدف NA 25x / 0.95 NA بمسافة عمل 4 مم.
2. قم بتشغيل جميع معدات التصوير ذات الصلة. ضع العينة على المسرح وضع قطرة من محلول مطابقة معامل الانكسار في الجزء العلوي من حجرة التركيب.
3. اقترب بعناية من وسائط الغمر مع الهدف وشكل عمودا مستمرا من الوسائط.
4. باستخدام التألق العرضي ، ابحث عن مجال تصوير مناسب.
5. ابدأ إجراء الحصول على الصور عن طريق اختبار الإعدادات المناسبة.
   1. ابدأ بضبط إعدادات الدقة وسرعة المسح باستخدام الشكل 2A كدليل. في حالة التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر ، أغلق الثقب بالكامل للحصول على أصغر قسم بصري وبالتالي أفضل دقة z.
   2. قم بزيادة طاقة الليزر / كسب المستشعر تدريجيا حتى يتم الحصول على صورة مناسبة بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية.
   3. إذا كنت تستخدم التصوير القياسي بلونين EGFP / tdTomato ، فقم بتعيين إعدادات مجموعة الضوء باستخدام الشكل 2B كدليل.
   4. قم بتعيين معلمات z-stack بناء على نقطتي البداية والنهاية المرصودة للأنسجة. قم بتعيين حجم الخطوة بناء على دقة z المطلوبة باستخدام الشكل 2C كدليل.
      ملاحظة: ستؤدي أحجام الخطوات الأصغر إلى دقة z أكبر ولكنها ستقدم أيضا مزيدا من وقت السكون في الليزر ، مما قد يؤدي إلى تبييض العينة.
   5. عندما تكون راضيا عن إعدادات الحصول على الصور ، احصل على الصورة.
   6. تأكد من أن الصورة تحتوي على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية وتظهر حدودا مميزة للهياكل ( الشكل 2D).

3. معالجة الصور والقياس الكمي ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج تحليل الفحص المجهري

ملاحظة: حزم برامج تحليل الصور المجهرية هي أدوات قوية لتصور الصور ثلاثية الأبعاد ومعالجتها. العديد من هذه البرامج مناسبة تماما للتعامل مع مجموعات البيانات الكبيرة التي يتم إنشاؤها من تصوير عينات الأنسجة التي تم تطهيرها. تتوافق الخطوات التالية والأرقام المرتبطة بها مع سير عمل برنامج Imaris.

1. افتح مكدس الصور واستيراده إلى برنامج التحليل المحدد.
2. اعرض الصورة في مساحة ثلاثية الأبعاد وقم بإجراء أي تغييرات مطلوبة على جداول البحث باستخدام أداة ضبط العرض لتصور الصورة بشكل أفضل.
   ملاحظة: الشكل 3 أ يوضح عمق التصوير الشديد المحتمل الذي يمكن الوصول إليه من خلال الفحص المجهري ثنائي الفوتون المقترن بتنظيف الأنسجة CLARITY. الشكل 3B يظهر عمليات التغصنات المميزة بالإضافة إلى أشكال العمود الفقري المرئية بوضوح من z-stack المعروضة في {{TAG_ 320}} الشكل 3 أ .
3. لتصفية أي خلفية متسقة، انقر فوق الزر معالجة الصور وحدد مرشح طرح الخلفية.
   ملاحظة: الشكل 3C يعرض الصورة بإشارة خلفية ضبابية متسقة قبل المعالجة. الشكل 3D يعرض الصورة بعد تطبيق مرشح طرح الخلفية.
4. راقب الصورة ثلاثية الأبعاد وتعرف عليها من خلال النظر إليها من زوايا متعددة ومستويات التكبير.
5. ابدأ تتبع التغصنات عن طريق تحديد أداة التتبع.
6. انقر فوق قم بتحرير الفتيل يدويا ، وتخطي الإنشاء التلقائي .
7. اضبط الوضع على المسار التلقائي وتحقق من و تصحيحات.
8. Shift + انقر بزر الماوس الأيمن على جسم الخلية لتعيين نقطة بداية.
9. تتبع الخلايا العصبية على طول التغصنات بالكامل. انقر بزر الماوس الأيسر على نهاية التغصنات لتعيين نقطة الإنهاء للسماح للبرنامج بحساب المسار تلقائيا بين نقطتي البداية والنهاية.
10. كرر هذه الخطوة لجميع التشعبات ، وتتبع بنية الخلية بالكامل.
11. تصور الخلية التي تم تتبعها وتأكد من دقتها. قم بإجراء التعديلات اليدوية حسب الحاجة.
12. حدد علامة التبويب الإنشاء {{TAG_440}
13. حدد الخيار {{TAG_450 TAG_451}}.
14. اتبع المعالج حتى الانتهاء للحصول على تغصنات أكثر دقة.
15. حدد علامة التبويب ارسم }
16. انقر فوق زر الاختيار العمود الفقري لبدء رسم العمود الفقري.
17. اضبط قطر العمود الفقري التقريبي حسب الحاجة ، واستخدم أداة القياس للحصول على تمثيل دقيق لأقطار العمود الفقري.
18. انقر فوق منتصف رؤوس العمود الفقري لإضافة عمود فقري جديد.
19. كرر هذا لجميع الأشواك الموجودة على التغصنات.
    ملاحظة: من المهم مراقبة التغصنات من جميع الزوايا الممكنة عند إضافة الأشواك يدويا.
20. تحقق من الأشواك المضافة حديثا للتأكد من دقتها وقم بإجراء التغييرات حسب الحاجة.
21. حدد علامة التبويب {TAG_523{{TAG_524}TAG_525} {{}}} {
22. حدد خيار TAG_537 للسماح للبرنامج بتحديد أقطار الرأس والرقبة المناسبة ، والتي تعتبر ضرورية لتحليل البيانات النهائية.
23. اتبع معالج إنشاء قطر العمود الفقري حتى الانتهاء.
24. راقب نتيجة الحساب وقم بإجراء أي تعديلات يدوية حسب الحاجة. يوضح الشكل 3E خلية عصبية متتبعة بالكامل كاملة مع العمود الفقري.
25. لإنشاء قائمة مصنفة من العمود الفقري، حدد أدوات }.
    ملاحظة: يجب تثبيت ملحق MATLAB حتى يعمل هذا.
    1. لتثبيت ملحق MATLAB ، افتح نافذة التفضيلات.
    2. حدد الخيار الأدوات المخصصة.
    3. أضف وقت تشغيل MATLAB MCR المناسب.
26. انقر فوق تصنيف العمود الفقري.
27. قم بتحرير المعلمات المطلوبة لتصنيف العمود الفقري.
28. انقر فوق تصنيف العمود الفقري على امتداد MATLAB. الشكل 3F يظهر التغصنات المتراكبة بأشواك مصنفة مرمزة بالألوان.
29. حدد علامة التبويب الإحصائيات }
30. قم بتكوين الإحصائيات المطلوبة لتحديد البيانات بالنقر فوق تكوين الزر في الزاوية السفلية اليسرى من علامة التبويب.
31. {{ TAG_670}} بمجرد اختيار طريقة تمثيل الإحصائيات ، قم بتصدير البيانات باستخدام الزر تصدير الإحصائيات على علامة التبويب المعروضة إلى ملف الموجود في أسفل يمين هذه النافذة.
32. رسم الإحصائيات باستخدام طريقة الرسوم البيانية المفضلة.

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-ressize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: fixed ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets-baot = '1' > قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> 15 مل أنبوب مخروطي < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>Thermo Scientific < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> 339650 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> 25 جم × 1 بوصة نمط إبرة < td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: روبوت ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ > دينار بحريني< td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Roboto;حجم الخط:7pt;وزن الخط:عادي;الفائض:مخفي; الحشوة:0px 3px;المحاذاة الرأسية:أسفل;المساحة البيضاء:عادي;التفاف الكلمة:break-word;wrap-strategy:4;'>305127 < td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Roboto;حجم الخط:7pt;وزن الخط:عادي;الفائض:مخفي; الحشوة:0px 3px;المحاذاة الرأسية:أسفل;المساحة البيضاء:عادي;التفاف الكلمات:break-word;التفاف استراتيجية:4;'>30٪ أكريلاميد (بدون مكرر)< td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Roboto;حجم الخط:7pt;وزن الخط:عادي;الفائض:مخفي; الحشوة:0px 3px;المحاذاة الرأسية:أسفل;المساحة البيضاء:عادي;التفاف الكلمة:break-word;wrap-strategy:4;'>التشخيص الوطنيEC-810 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> 50 مل أنبوب مخروطي < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ >Thermo Scientific < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>339653 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Roboto;حجم الخط:7pt;وزن الخط:عادي;الفائض:مخفي; الحشوة:0px 3px;المحاذاة الرأسية:أسفل;المساحة البيضاء:عادي;التفاف الكلمة:break-word;التفاف استراتيجية:4;'>حل تطهير الأنسجة الكهربية< td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>LogosC13001< td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> HistodenzSigmaD2158-100G < td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Roboto;حجم الخط:7pt;وزن الخط:عادي;الفائض:مخفي; الحشوة:0px 3px;محاذاة عمودي:أسفل;المساحة البيضاء:عادي;التفاف الكلمة:break-word;wrap-strategy:4;'>Hydrogel Solution Kit< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> الشعارات < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: الروبوت ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ > C1310X< td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Imarisأكسفورد إنسترومنتس< td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;line-weight:normal;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>N / A Paraformaldehyde 16٪< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> EMS< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: الروبوت ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ > 15710< td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> PBS, 1x, 500 mL, 6 زجاجات / علبة فيشر < نمط = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: الروبوت ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ >MT21040CV< td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> VA-044925-41020 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ نظام بلمرة X-CLARITY >< td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Roboto;حجم الخط:7pt;وزن الخط:عادي;الفائض:مخفي; الحشوة:0px 3px;المحاذاة الرأسية:أسفل;المساحة البيضاء:عادي;التفاف الكلمات:break-word;wrap-strategy:4;'>LogosC20001< td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> X-CLARITY نظام تنظيف الأنسجة IILogosC30001< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>