الفحص المجهري ثنائي الفوتون للخلايا النجمية والخلايا العصبية المثيرة في أنسجة الحصين الفأرية التي تم تطهيرها

الملخص

المصدر: ر. ، وآخرون ، التحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في الأدمغة التي تم تطهيرها. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح الفيديو التحضير غرفة والتصوير العصبي لأنسجة الحصين الفأرية التي تم تطهيرها باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتصور التفاعلات المكانية بين الخلايا النجمية المسماة بالفلورسنت والخلايا العصبية المثيرة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المناسبة.

1. تحضير الغرفة

} ملاحظة: تتطلب كل عينة شريحة بها غرفة تصوير ستوضع العينة فيها.

1. ضع العينة في منتصف الشريحة.
2. باستخدام مسدس الغراء الساخن ، قم بإنشاء جدران على حواف الشريحة ، بارتفاع الأنسجة. تأكد من ترك فجوة صغيرة (حوالي 5 مم) في إحدى الزوايا ( الشكل 1 أ ، ب ).
3. ضع 1-2 قطرات من محلول مطابقة معامل الانكسار أو RIMS على العينة للحفاظ على رطوبة السطح العلوي ومنع تكون الفقاعات بين الغطاء والنسجة.
4. مباشرة بعد تطبيق قطرات RIMS (محلول مطابقة معامل الانكسار) ، أضف الطبقة الأخيرة من الغراء الساخن إلى الجدران (بحيث تصل إلى ارتفاع الدماغ / الشريحة) وتقدم على الفور (بينما لا يزال الغراء الساخن سائلا) إلى الخطوة 1.5.
5. أغلق الجزء العلوي بقلة غطاء ، وضعه بالتساوي قدر الإمكان على الجزء العلوي من طبقة الغراء الساخن التي لا تزال دافئة ( الشكل 1C ).
6. املأ الغرفة ب RIMS من خلال الفجوة المتبقية في جدران الغراء الساخن ( الشكل 1D ، E).
7. أغلق الفجوة بالغراء الساخن. لا تترك أي هواء بالداخل ( الشكل 1F).
8. إذا امتدت جدران الغراء الساخن إلى ما وراء حدود الشريحة، فقم بقص الحواف الممتدة ( الشكل 1G).
9. إذا كان الهدف المستخدم للتصوير مغمورا ، فأضف 2-3 مم أخرى من الغراء إلى الجدران فوق الغطاء بحيث يستمر محلول الغمر لفترة أطول ( الشكل 1H ).

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: fixed ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets-baot = '1'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>AAV1-GFAP:: TdTomatoELSC Vector Core Facility (EVCF) < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom;'> vector viral used to detect astrocytesAAV5-CaMKII::eGFPELSC Vector Core Facility (EVCF) vector viral used to detect neuronsAAV5-CaMKII::H2B-eGFPELSC Vector Core Facility (EVCF) < td style = 'overflow: مخفي ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة رأسية: أسفل ؛ مساحة بيضاء: طبيعية ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> ناقل فيروسي يستخدم للكشف عن النوى العصبيةAAV5-CaMKII::TdTomatoELSC Vector Core Facility (EVCF) vector viral used to detect neuronsImaris softwareBitplane, UK برنامج يسمح بتحليل ثلاثي الأبعاد للصورRapiClearSunJin lab#RC147002< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> RapiClear CSSunJin lab#RCCS002< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> SyGlass software اثنين من المجهر الفوتوني < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>Neurolabware< td style = 'overflow: مخفي ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة عمودية: أسفل ؛ مساحة بيضاء: عادية ؛ التفاف الكلمة: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>Ti: ليزر الياقوت (Chameleon Discovery TPC ، متماسك) ، أنابيب مضاعف الصور GaAsP (Hamamatsu ، H10770-40) ، مرشح ممر النطاق (Semrock) ، الغمر في الماء 16x الهدف (نيكون ، 0.8 NA) < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>VA-044 Initiator< td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>Wako # 011-19365< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>