التصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الدقيقة والنشاط العصبي في فأر مستيقظ

الملخص

المصدر: ماروكا، إتش.، وآخرون. al. {{}} التصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الدقيقة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة. J. Vis. Exp.. (2022)

} يعرض هذا الفيديو إجراء فحص مجهري ثنائي الفوتون لتصوير النشاط العصبي وديناميكيات الخلايا الدبقية الدقيقة في فأر مستيقظ أثناء التحفيز البصري ، مع تسليط الضوء على عابرات الكالسيوم والتفاعلات الخلوية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

في الجسم الحي التصوير ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة وديناميكيات الكالسيوم العصبية

1. تعويد الفئران على جهاز المجهر

1. بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة ، قم بتحفيز التخدير في الفأر بنسبة 3٪ من الأيزوفلوران ، ووضع الفأر تحت العدسة الموضوعية 25x لمجهر ثنائي الفوتون باستخدام أداة تجسيمية مخصصة ( الشكل 1C ). للإعداد ، يتم ضبط الماوس على الجزء العلوي من جهاز المشي ويسمح له بالركض بحرية.
2. بعد حوالي 10 دقائق ، قم بإزالة الماوس من مرحلة المجهر وأعده إلى قفص المنزل. كرر التعود 3 مرات على الأقل كل يوم بديل قبل الحصول على صورة ثنائية الفوتون.

2. الحصول على صورة ثنائية الفوتون

ملاحظة: نوصي بإجراء الحصول على الصورة بعد أكثر من 4 أسابيع من الجراحة، حيث يعود تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة تدريجيا إلى المستوى الأساسي.

1. قم بتحفيز التخدير في الفأر باستخدام 3٪ من الأيزوفلوران ووضع الماوس تحت العدسة الموضوعية للمجهر ثنائي الفوتون باستخدام أداة تجسيمية مخصصة.
2. قم بتثبيت جهاز التظليل المخصص ( الشكل 1A و الشكل 1B) وشاشة LCD للتحفيز البصري كما هو موضح أدناه ( الشكل 1D).
   1. ضع العدسة للتركيز على سطح الدماغ، ثم اضبط موضع العدسة هذا على الموضع Z الأصلي. حافظ على إحداثيات xy ثابتة ورفع العدسة الموضوعية. قم بإزالة الماوس والأداة التجسيمية من العدسة الموضوعية وجهاز المشي.
   2. قم بتوصيل جهاز تظليل في الجزء العلوي من لوحة الرأس باستخدام السيليكون ، والذي يتم تسويته باللون الأسود عن طريق الخلط بمسحوق الفحم ، وتأكد من أن المسافة بين لوحة الرأس وجهاز التظليل محكمة الإغلاق.
   3. املأ جهاز التظليل بالماء المقطر ، ثم قم بإصلاح الماوس والإطار التجسيمي مرة أخرى تحت الهدف وعلى جهاز المشي. أعد ضبط المستوى البؤري على سطح الدماغ بعناية ، وتحقق من عمق العدسة الشيئية.
      ملاحظة: لتجنب خطر إتلاف العدسة الشيئية ، اضبط إحداثيات xyz أولا ، ثم قم بتطبيق جهاز التظليل للعدسة الشيئية. من المعقول أيضا تثبيت الغطاء أولا ، ثم ضبط الإحداثيات ، ولكن من الضروري التعامل الحذر لهذا الخيار.
   4. قم بتغطية العدسة الموضوعية بورق الألمنيوم الأسود لتجنب تلوث الضوء من شاشة LCD المستخدمة للتحفيز البصري من خلال العدسة الشيئية ( الشكل 1D ). اضبط شاشة LCD مقاس 10 بوصات على 12.5 سم أمام عيني الماوس لتقديم المحفزات البصرية ( الشكل 1D ).
3. قم بتكوين مرشحات تجميع انبعاث التألق على مضان EGFP (مرشح انبعاث 525/50 نانومتر) ومضان R-CaMP (مرشح انبعاث 593/46 نانومتر) والطول الموجي للإثارة إلى 1,000 نانومتر. احصل على صور بدقة مكانية تبلغ 0.25 ميكرومتر / بكسل باستخدام هدف NA 25x 1.1 و GaAsP PMTs.
4. ابحث عن منطقة التصوير التي يمكن فيها تصوير الخلايا العصبية R-CaMP (+) و EGFP (+) microglia في وقت واحد في الطبقة 2/3. بالنسبة لهذا الإعداد، كانت البيانات التي تم الحصول عليها في الشكل 2 على عمق 100 ميكرومتر من سطح القرص، باستخدام معاينة صورة حية. حافظ على قوة ليزر الإثارة منخفضة قدر الإمكان لتجنب التبييض الضوئي والأضرار الناجمة عن زيادة درجة الحرارة المحلية في منطقة التصوير.
5. الحصول على الصور بمعدل إطارات 30 هرتز. بالتزامن مع الحصول على الصورة, تقديم محفزات بصرية الانجراف صريف عند 100٪ تباين, 1.5 هرتز, 0.04 دورة لكل درجة في 12 اتجاها في 6 اتجاهات من 0 ° إلى 150 درجة في 30 درجة خطوات إلى الماوس.
6. بعد الحصول على الصورة ، قم بإزالة الماوس من مرحلة المجهر ، وافصل جهاز التظليل والأداة التجسيمية عن الماوس ، وأعد الماوس إلى قفص منزله.

النتائج

المواد