القياس الكمي للخلايا العصبية المتولدة حديثا في أنسجة دماغ الفئران باستخدام تقنية التجزئة البصرية

الملخص

Source: Olesen, M. V., et al. تقنية التجزئة البصرية لتقدير أعداد الخلايا في نموذج الفئران للعلاج بالصدمات الكهربائية. J. Vis. Exp. (2017).

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة. style='background-color:#ffffff;line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:10pt;palding:0pt 0pt; text-align:justify;' dir='ltr'>1. معالجة الأنسجة

< نمط p = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ ارتفاع الخط: 1.2 ؛ أسفل الهامش : 11 نقطة ؛ الهامش العلوي: 0 نقطة ؛ الحشو: -1 نقطة 0 نقطة ؛ الحشو : -1 نقطة 0 نقطة ؛ 'dir = 'ltr '>< span style = 'لون الخلفية: شفاف ؛ اللون: #1a202c ؛ '>< span style = 'font-family: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ محاذاة رأسية: خط الأساس ؛ المسافة البيضاء: التفاف مسبق ؛ '>ملاحظة: after perfirial transcardial and postتثبيت في 4٪ paraformaldehyde (PFA) المخفف في 0.2 M مخزن للفوسفات بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية، يتم نقل الأدمغة إلى 30٪ من السكروز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة ثلاثة أيام عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، يتم تجميد الأدمغة على مسحوق الثلج الجاف وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى التقسيم.

1. افصل نصفي الكرة الأيمن والأيسر على طول خط الوسط للدماغ باستخدام مشرط. ثم اختر نصفي الكرة الأرضية أو الآخر بشكل عشوائي في الدماغ الأول. بعد ذلك ، قم بالتبديل بشكل منهجي بين نصفي الكرة الأيمن والأيسر (الشكل 1Aالشكل 1 ب).
   1. ضع جميع الأقسام التي تم أخذ عينات منها على التوالي في الحاويات متعددة الأطباق المبردة للحفاظ على الأقسام في ترتيب القطع.
   2. 2. Immunostaining

      NOTE: لتتبع الأقسام الفردية طوال إجراء التلوين، ضع الأقسام التي تم أخذ عينات منها في شبكات تلطيخ مكونة من 25 بئرا. استخدم كل قسم 5 ، مع إعطاء متوسط العدد النهائي البالغ 12 (8-16) قسما لكل الحصين للتلوين المناعي وعد الخلايا اللاحق.

      1. قبل أخذ عينات فرعية من كل قسم nth مع بداية عشوائية بين القسمين الأول و n (الشكل 1C) انقل الحاويات من -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
      2. NOTE: ₂O2) مخفف في الماء المقطر (dH₂O) لمدة 20 دقيقة.
      4. ₂O2 لمدة 10 دقائق في RT.
      5. ₂₂O لمدة 15 دقيقة. style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Arial,sans-serif;حجم الخط:12pt;نمط الخط:عادي;متغير الخط:عادي;وزن الخط:400;نوع نمط القائمة:عشري;زخرفة النص:لا شيء;محاذاة عمودي:خط الأساس;المسافة البيضاء:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>3. تقدير العدد الإجمالي للخلايا العصبية المسماة BrdU باستخدام التجزئة بصرية

         NOTE: إجراء دراسة تجريبية تتضمن عددا قليلا من لتحديد معلمات أخذ العينات المثلى، مثل عدد الأقسام المراد تحليلها وعدد التشريح البصري داخل الأقسام التي تم أخذ عينات منها. يوفر هذا الطيار أيضا سيرة ذاتية أولية (الانحراف المعياري / المتوسط) وإمكانية تعديل CE للحصول على دقة مرضية للتقديرات التي يحددها المحقق (لمزيد من التفاصيل ، انظر أدناه). وبالمثل ، سيتناول تحليل التوزيع z النقاط التالية: انكماش الأنسجة ، وجودة التلوين في جميع أنحاء القسم ، وتوزيع الخلايا في المحور z.

         1. check the thickness of the tissue in sections للتأكد من أنها مناسبة لاستخدام المجزأ البصري، على سبيل المثال، سميكة بما يكفي لارتفاع القسم المختار، بما في ذلك مناطق الحراسة (انظر أدناه). NOTE: يتم قياس سمك الأنسجة في عدة أماكن داخل منطقة الاهتمام. style='هامش أسفل:0;الهامش العلوي:0;padding-inline-start:48px;'>
         2. ضع الشرائح على المسرح الآلي للمجهر وقم بتشغيل البرنامج التجسيمي المفضل.
         3. الشكل 2A على سبيل المثال ، الشكل 2B). style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:عادي;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>الشكل 2 ب < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المسافة البيضاء: التفاف مسبق ؛ >).
         style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Arial,sans-serif;حجم الخط:12pt;نمط الخط:عادي;font-variant:عادي;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>NOTE:
      6. sample neurons label-BrdU and sign z-position with the z-position with the local thickness that that is in the corner المحددة من كل إطار عد. style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Arial,sans-serif;حجم الخط:12pt;نمط الخط:عادي;متغير الخط:عادي;وزن الخط:400;نوع نمط القائمة:عشري;زخرفة النص:لا شيء;محاذاة عمودي:خط الأساس;المسافة البيضاء:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>NOTE:
      7. حدد منطقة الاهتمام في جميع الأقسام المراد تحليلها وتسجيل المناطق.
      8. NOTE:_step).
      9. _الخطوة < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ محاذاة رأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ '> ، والتي ستوفر حجم الخطوة xy.
      style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Arial,sans-serif;حجم الخط:12pt;نمط الخط:عادي;font-variant:عادي;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>
   3. اضبط حجم إطار العد على وحدة عشوائية وقم بإجراء أخذ عينات تجريبية من الخلايا العصبية الإيجابية BrdU باستخدام المعلمات التي تم الحصول عليها في القسمين 3.3 و 3.4.
      NOTE:NOTE: الشكل 2 ب style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;-space:pre-wrap;'>). لا تحسب الخلايا العصبية الإيجابية BrdU التي تلامس خطوط الاستبعاد عند التعرف عليها بوضوح من خلال ميزة الاهتمام داخل ارتفاع التشريح. من المهم للغاية اتباع قواعد العد هذه بعناية طوال القياس الكمي التجسيمي بأكمله.
      NOTE:

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' style = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets-baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdUSigma-Aldrich19-160 Cresyl VioletSigma-AldrichC5042يحتوي على ما يلي المواد
ل 1 لتر: 0.2 غرام كريسيل البنفسجي ؛ 2.0 جم
صوديوم أسيتات ، 3 H2O ؛ 3 مل من حمض الأسيتيك الجليدي
؛ 1000 مل مقطر
ماء Cryoprotectant< td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>صيدلية منطقة العاصمة ، DK < td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛>861334يحتوي على المواد التالية:
سكروز؛ polyvinylpyrrolidon PVP
40؛ sodiumphosphatebuffer (0.2
M); ethylenglycol; منزوعة المعادن
الماء.dH2OCapital Region Pharmacy, DK817205< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Diaminobenzidine – DABSigma-AldrichD5637 Envision-HRPDAKOK4001البوليمر المسمى البيروكسيداز
مترافق مع الماعز المضاد للفأر
الغلوبولين المناعيEthanol - 70٪Plum A / S201098 الإيثانول - 96٪ Plum A / S201104< نمط td ='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> الإيثانول - 99.9٪Plum A / S201111 Fetal Bovine SerumIn vitroBI-04-003-1A H2O2 30٪ Capital Region Pharmacy, DK896456 HClJ. T. Baker6081 متوسط التركيب<نمط td ='حجم الخط: 12pt؛ الفائض: مخفي؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل؛ المحاذاة الرأسية: أسفل;'>Sakura4583الماوس المضاد ل BrdU < td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>Becton-Dickinson < td style = 'font-size: 12pt ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> 347580 < td style = 'font-size: 12pt ؛ overflow: hidden; padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>PBS buffer Capital Region Pharmacy, DK853436ph = 7.4PFAVWR28,794,295pH = 7.4Phosphate Buffer866533 < td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>0.1 مول / لتر ، الرقم الهيدروجيني 7.4< td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> التجفيف السريع التركيب المتوسط< نمط td = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>منتجات Histolab AB801Pertexرباعي الصوديوم رباعي الصوديومMerck A / S1,063,080,500 SucroseMerck A / S1,076,515,000 Triton X-100Merck A / S1,086,031,000 XyleneVWR28,973,363 Cover slipsMenzel-Gläser < td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Cryost < td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>Leica < td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>CM1860< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Digital MicrocatorHeidenhainVRZ 401 Glass BuildingsBrain Resaerch Laboratories1256 المجهرNikonEclipse 80i Microscope cameraDP72 microscope sliesVWR48311-703SuperFrost+Motorized stagePrior Multidish ContainersSigma-AldrichD6315-1CS< td style='حجم الخط: 12pt؛ overflow: مخفي؛ الحشوة: 0px 3px؛ المحاذاة الرأسية: أسفل;'>Nuclon 12-wellsnew-cast softwareVisiopharmver. 4.5.6.440 Objective 2xNikonCFI Plan UW 2X الموضوعي 4xNikonCFI Plan Fluor 4X Objective 10xNikonCFI Plan Fluor 10X الهدف 100x الغمر في الزيت < td style = 'حجم الخط: 12pt ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>Nikon CFI Plan Apo Lambda DM 100X
Oil الفتحة العددية 1.40شاكر المدارGemini BVCM-9Sarstedtرف الشرائح < نمط td = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> ساكورا < نمط td = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 4465 < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> نمط < نمط TD = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> أطباق تلطيخ الشريحة < نمط td = 'حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ >Sakura4457Tissue-TekSpecimen discLeica14037008637 Staining netsBrain Research Laboratories251225-wells