التحقيق في أصول الخلايا العصبية الحسية في الأم الجامدة باستخدام الفحص المجهري الفلوري

الملخص

المصدر: Wang, J., { et al. تصور التعصيب المناعي للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين في الأم الجافة للفئران مع التألق المناعي والتتبع العصبي. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتتبع أصول الخلايا العصبية الحسية في الأم الجافية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. يتم إدخال متتبع رجعي في الأم الجافية المكشوفة لفأر مخدر. يتم امتصاص المتتبع بواسطة المحاور العصبية الحسية وينتقل إلى الوراء إلى أجسام الخلايا داخل العقدة ثلاثية التوائم والعقد الجذرية الظهرية العنقية. ثم يتم تقسيم العقد ، وتلطيخها بالأجسام المضادة التي تصنف المتتبع والببتيدات العصبية في أجسام الخلايا ، ويتم تحليلها باستخدام المجهر الفلوري لتأكيد الأصول العقدية للخلايا العصبية الحسية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. دراسة التتبع الرجعي باستخدام الفلوروجولد (FG)

1. الإجراءات الجراحية
   1. تحديد منطقة الاهتمام الإحداثية في الأم الجافية في الجمجمة للفئران.
   2. قم بإعداد حقنة صغيرة سعة 10 ميكرولتر واختبرها بالبارافين السائل.
   3. تخدير الفئران بمحلول ثلاثي البروم الإيثانول (150 مجم / كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تحقق من عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم.
   4. احلق رأس الجرذ بشفرة حلاقة كهربائية.
   5. ضع قضبان أذن حادة على الفئران وضعها على الجهاز التجسيمي. ثم ضع حامل الفم ووضع مرهم للعيون على العينين.
   6. نظف الموقع الجراحي لجلد الرأس باستخدام 10٪ بوفيدون اليود متبوعا بنسبة 75٪ إيثانول.
   7. قم بعمل شق على طول خط الوسط لفروة الرأس.
   8. قم بإزالة السمحاق والأنسجة العضلية بصراحة بعيدا عن الجمجمة باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية ( الشكل 1 أ ).
   9. قم بحفر حفرة صغيرة (~ 5-7 مم) باستخدام مثقاب لتوغ مع لقمة ذات طرف دائري (# 106) على العظام الجدارية والزمنية اليسرى فوق الشريان السحائي الأوسط (MMA) ، وتأكد من بقاء الأم الجمجمة سليمة ( الشكل 1 ب ).
   10. قم ببناء بنك حول الحفرة باستخدام أسمنت سيليكات الأسنان للحد من انتشار جهاز التتبع ( الشكل 1C).
   11. أضف 2 ميكرولتر من 2٪ FG في الحفرة حول MMA باستخدام حقنة صغيرة سعة 10 ميكرولتر ( الشكل 1D ).
   12. قم بتغطية الفتحة بقطعة صغيرة من الإسفنجة المرقئة.
   13. ضع قطعة من فيلم البارافين على الفتحة وأغلق الحواف بشمع العظام لمنع تسرب المقتفي وتجنب تلويث الأنسجة المحيطة.
   14. خياطة الجرح بخيط معقم.
   15. احتفظ بالجرذان في مكان دافئ حتى تتعافى تماما.
   16. أعد الفئران إلى أقفاصها وأضف مضادا حيويا ومسكنا إلى مياه الشرب.
2. التروية والأقسام
   1. بعد 7 أيام من البقاء على قيد الحياة ، قم ببث هذه الفئران.
   2. قم بتشريح العقدة ثلاثية التوائم (TG) والعقد الجذرية الظهرية C1-4 (DRGs) ، ثم قم بإصلاحها بعد إصلاحها وحمايتها بالتبريد ( الشكل 1F ).
   3. قم بقص TG و DRGs بسمك 30 ميكرومتر على نظام cryostat microtome في الاتجاه السهمي ومثبتة على شرائح زجاجية مطلية بالسيلان.
3. النورات المناعية المزدوجة لوضع العلامات على الببتيد المرتبط بالجينات FG والكالسيتونين (CGRP) في TG و DRGs
   ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن ملاحظة وضع العلامات على FG مباشرة مع إضاءة الأشعة فوق البنفسجية (UV) تحت مصباح الزئبق دون تلطيخ إضافي ، إلا أن الخلايا العصبية المصنفة مع FG تم فحصها بشكل أكبر في TG و DRGs عنق الرحم باستخدام النورات المناعية المزدوجة مع FG و CGRP للكشف عنها أصول الألياف العصبية الجافية التفاعلية المناعية CGRP في TG و DRGs.
   1. ضع دائرة حول الأقسام بالقلم الكيميائي النسيجي.
   2. احتضان الأقسام لمدة 30 دقيقة في محلول مانع يحتوي على 3٪ مصل حمار عادي و 0.5٪ Triton X-100 في محلول فوسفات 0.1 M (PB).
   3. انقل العينات إلى محلول الأرانب المضادة للفلوروجولد (1: 1000) والجسم المضاد للفأر المضاد ل CGRP (1: 1000) في 0.1 M PB يحتوي على 1٪ مصل حمار عادي و 0.5٪ Triton X-100 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
   4. اغسل الأقسام ثلاث مرات في 0.1 M PB في اليوم التالي.
   5. احتضن في محلول مختلط من الحمير المضادة للأرانب Alexa Fluor 594 (1:500) والحمار المضاد للفأر Alexa Fluor 488 (1: 500) الجسم المضاد الثانوي في 0.1 M PB يحتوي على 1٪ مصل حمار عادي و 0.5٪ Triton X-100 لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   6. اغسل وقم بتطبيق أغطية على الأقسام.
4. المراقبة والتسجيل
   1. التقط صورا للخلايا العصبية المسماة FG في TG و DRGs تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية بواسطة مجهر فلورسنت مزود بكاميرا رقمية.
   2. التقط صورا للخلايا العصبية المسماة FG و CGRP في TG و DRGs تحت مجهر فلوري مزود بكاميرا رقمية.
   3. استخدم برنامج التحرير لضبط سطوع الصور وتباينها وإضافة ملصقات في الصور.

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط : 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets-baot = '1' > قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H + L)Invitrogen by Thermo Fisher ScientificA21202Protect from Light; RRID: AB_141607Brain stereotaxis instrumentNarishigeSR-50 CellSens DimensionOlympusVersion 1.1Software of fluorescent المجهر Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Protect from lightFluorescent imaging systemOlympusBX53 Frozen microtomeThermomicrom InternationalGmbH<td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7 Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121 Phalloidin 568Molecular ProbesA12380Protect from lightPhotoshop and IllustrationAdobeCS6Photo editing softwareRabbit anti- FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738Sprague Dawleyالمعاهد الوطنية للرقابة على الغذاء والدواءSCXK (JING) 2014-0013 Superfrost plus microscope slidesThermo#4951PLUS-001< نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 25 × 75 × 1 مم