مراقبة استعادة الخلايا الروضة بين الأعصاب بالليزر في أسماك الزرد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر

الملخص

المصدر: Volpe, B. A. , et al. {{}} الاستئصال بالليزر القائم على المجهر متحد البؤر وفحص التجديد في الخلايا العصبية بين الزرد. J. Vis. Exp.{{TAG_ 31}} (2020)

} يوضح هذا الفيديو مراقبة استعادة الخلايا المادية بين الأعصاب في أسماك الزرد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، وتتبع موت الخلايا وإصلاحها من خلال التصوير الفلوري بفاصل زمني.

البروتوكول

1. تصوير ما بعد الاستئصال والفحص المجهري بفاصل زمني لدراسة التجديد

1. انقر فوق القائمة المنسدلة ل " القنوات ". في القنوات، قم بإلغاء النقر فوق المسار " DAPI"(4′,6-diamidino-2-phenylindole) لتعطيل ليزر الاستئصال. انقر فوق القائمة المنسدلة ل " وضع الاستحواذ ".
2. في وضع الاستحواذ ، انقر فوق "} ".
3. قلل التكبير/التصغير إلى 0.7 إما باستخدام شريط التمرير أو عن طريق كتابة "0.7."
   1. لضمان استئصال الخلايا الناجح، قم بزيادة الكسب إلى 900 ومسح مجال الرؤية بسرعة.
      ملاحظة: يجب ألا يكون GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) مرئيا داخل الخلية أو الخلايا المستهدفة. باستخدام نفس الإعدادات أو الإعدادات المشابهة لتلك الموضحة للتصوير المسبق للاستئصال ، التقط وحفظ صورة ما بعد الاستئصال ( الشكل 1C ). إذا كشفت الصورة عن بقايا خلايا فلورية أو أجسام خلوية إضافية تحتاج إلى إزالتها ، فكرر خطوات الاستئصال بالليزر لإنشاء فجوة مرئية في سلسلة الخلايا الحجرية بين الخلايا العصبية.
   2. افحص صورة قناة T-PMT (أنبوب المضاعف الضوئي للإرسال) لتأكيد الضرر الخلوي بشكل أكبر. سيكون للخلايا التالفة مظهر حبيبي ، وسوف تنتفخ النوى بشكل متكرر أو تصبح غير منتظمة الشكل ( الشكل 2 ).
4. بعد التقاط صورة ما قبل الاستئصال ، واستئصال الخلايا حسب الضرورة ، والتقاط صورة ما بعد الاستئصال لكل موضع مرحلة فردية ، قم بإعداد الفحص المجهري للفاصل الزمني عن طريق تنشيط كل من موضع المرحلة وخيارات الوقت لالتقاط الصورة. قم بتعيين معلمات الوقت إلى 24 ساعة أو نقطة نهاية أخرى مطلوبة وفواصل زمنية مدتها 15 دقيقة. ابدأ التجربة للحصول على الصور وحفظ الملف الناتج عند اكتماله (في اليوم التالي).
5. إذا كان سيتم مزيد من دراسة اليرقات أو تربيتها ، فقم بإزالتها بعناية من الاغاروز باستخدام ملقط ناعم ، ثم انقلها إلى وسط E3 بدون تركايين للتعافي. إذا لم يتم استخدامها أكثر ، فقم بالقتل الرحيم وفقا لبروتوكول المعتمد (الغمر السريع والمستمر في حمام جليدي طريقة شائعة) وتخلص منها كما تطلبه المؤسسة.

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets-root = '1' data-sheets-baot = '1' > قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات '12-well PTFE Printed SlidesElectron Microscopy Sciences63425-05 15 mM Tricaine stock solutionSigmaE10521 < td style = 'font-family: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ > 15 ملي مولار Tricaine في ماء التناضح العكسي 1X E3 + 600 μM Tricaine تمييع 15 ملي مولار مخزون التريكايين 25X في وسائط 1X E31X E3 media تمييع وسائط 60X E3 إلى 1X في ماء التناضح العكسي (16.7 مل / لتر)60 × E3 mediaجميع المكونات المشتراة من Sigma-Aldrich 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 لتر ماء التناضح العكسي Bx60 مجهر مركب مع مضان مصباح قوس الزئبق < td style = 'font-family: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>أوليمبوس< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> LSM 700 confocal microscope مزود بليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 555 أو 561 نانومترCarl Zeiss Microscopy، LLC FIJI/ImageJ Image processing software Downloadable at https://fiji.sc/تشريح إبرة معدلة إلى سكين شعر< td style = 'font-family: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> فيشر العلمي < td style = 'font-family: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ > 19010 تم لصق رمش على نهاية إبرة تشريح بمقبض خشبيMicrosoft Excel softwareMicrosoft Corp. Google sheets is alternative free for Microsoft Excelأطباق زجاجية ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم مع غطاء رقم 1.5 ، نافذة 20 مم < نمط TD = 'عائلة الخط: روبوت ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> Mattek Corporation < td style = 'font-family: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> P35G-1.5-20-CImmersol 518F Immersion Oil Fisher Scientific12-624-66A Low Gelling AgaroseSigma Life ScienceA9414-256 إدراج Corning Netwell مع شبكة بوليستر 74 um ، إدراج 24 مم < نمط td = 'عائلة الخط: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>Millipore Sigma < td style = 'font-family: Roboto ؛ حجم الخط: 7pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>CLS3479 -48EA< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Rstudio softwareRstudio PBC< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Downloadable at https://rstudio.com/SMX-168-BL مجهر ستيريو< td style='عائلة الخط: الروبوت؛ حجم الخط: 7pt؛ وزن الخط: عادي؛ الفائض: مخفي؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل؛ المحاذاة الرأسية: أسفل؛ المساحة البيضاء: عادي؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة؛ استراتيجية التفاف: 4؛ '>Motic نمط نقل الماصةفيشر العلمي13-711-7M ZEN softwareCarl Zeiss Microscopy, LLC