تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الرحلان الأيوني للصبغة الفلورية في شريحة دماغ الفأر الثابتة

الملخص

المصدر: موي، س. ل.، }et.al. تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الرحلان الأيوني الأصفر لوسيفر. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو استخدام الرحلان الأيوني للصبغة الفلورية لدراسة مورفولوجيا الخلايا النجمية في شرائح الدماغ الثابتة. إنه يوضح بالتفصيل ثقب سوما الخلايا النجمية باستخدام قطب كهربائي لتوصيل صبغة أنيونية محبة للماء إلى السيتوبلازم تحت تيار منخفض الجهد ، مما يمكن الصبغة من نشر وتسمية سوما والفروع. ثم يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتصور الخلايا النجمية المسماة ، مما يوفر رؤى مورفولوجية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. ملء الخلايا النجمية بالرحلان الأيوني

1. اختبر القطب.
   1. ضع شريحة دماغية برفق في طبق زجاجي مليء ب 0.1 M PBS في درجة حرارة الغرفة. امسك الشريحة في مكانها باستخدام قيثارة بلاتينية بخيوط من النايلون.
   2. تأكد من توصيل القطب الكهربائي بمصدر جهد ووضع القطب الأرضي في الحمام الذي يحتوي على شريحة الدماغ.
   3. انقل الهدف إلى منطقة الدماغ التي تهمك.
   4. اخفض القطب الكهربائي في المحلول. تحت المجال الساطع ، انقله إلى مركز مجال الرؤية وفحصه بعناية باستخدام عدسة الغمر في الماء 40x للتأكد من ظهوره واضحا وبدون حطام أو فقاعات. إذا كان هناك أي شيء يسد طرف القطب ، فاستبدله بآخر جديد.
      ملاحظة: الانسداد هو مصدر قلق للقطب الكهربائي 200 MΩ. مع الطرد المركزي وترشيح محلول الصبغة قبل كل تجربة ، لا ينبغي أن تكون هذه مشكلة متكررة. ومع ذلك ، نظرا لأن طرف القطب صغير ، فقد يعلق النسيج أحيانا في الفتحة. لم يجد المؤلفون طريقة لمنع ذلك ، ولكن يمكن التعامل معه بسهولة ببساطة باستخدام قطب كهربائي جديد.
   5. تحت المجال الساطع ، اخفض القطب ببطء باتجاه الشريحة التي تتوقف فوق السطح مباشرة.
2. املأ الخلايا النجمية برحلان الأيونات.
   1. حدد الخلايا النجمية على عمق 40-50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة باستخدام تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC). ابحث عن الخلايا ذات السوماتا الممدودة البيضاوية الشكل التي يبلغ قطرها حوالي 10 ميكرومتر. بمجرد اختيار الخلايا النجمية ، انقلها إلى مركز مجال الرؤية.
      ملاحظة: الخلية الجيدة للرحلان الأيوني لها حدود واضحة ومحددة حولها. لا تختار الخلايا القريبة جدا من سطح الشريحة لأنه لا يمكن ملؤها بالكامل. يستغرق الأمر بعض الممارسة على مدى بضعة أيام حتى تتمكن من تحديد الخلايا النجمية بشكل روتيني لملء الصبغة. اعتمادا على منطقة الدماغ المستخدمة في التجربة ، قد يختلف عدد الخلايا النجمية. قد يؤثر هذا على الوقت اللازم لتحديد الخلايا النجمية قبل الملء.
   2. اخفض طرف القطب ببطء في الشريحة ، وانتقل عبر الأنسجة ، حتى يصبح على نفس مستوى جسم الخلية.
      ملاحظة: حرك القطب الكهربائي ببطء لتجنب إتلاف الأنسجة.
   3. بمجرد أن يصبح جسم الخلية للخلية النجمية مرئيا ومخططا بوضوح ، قم بدفع القطب الكهربائي إلى الأمام ببطء وبلطف. حرك القطب الكهربائي حتى يخنق الطرف سوما الخلية. حرك تركيز الهدف ببطء لأعلى ولأسفل لملاحظة ما إذا كان القطب داخل السوما.
      ملاحظة: يجب أن يكون طرف القطب داخل جسم الخلية ، ويجب ملاحظة مسافة بادئة صغيرة على سوما. لا تحرك القطب أكثر من ذلك لتجنب مرور الطرف عبر الخلية.
   4. بمجرد أن يكون طرف القطب داخل الخلية ، قم بتشغيل المحفز عند ~ 0.5-1 فولت وقم بإخراج التيار باستمرار إلى الخلية. باستخدام المجهر متحد البؤر ، راقب الخلية تمتلئ. قم بزيادة التكبير/التصغير الرقمي لرؤية تفاصيل الخلية والتأكد من أن طرف القطب الكهربائي مرئي داخل الخلية.
      ملاحظة: اخفض الجهد إذا بدا أن الصبغة تتسرب من الخلية أو تملأ خلايا أخرى في المنطقة المجاورة. إذا بدا أن الصبغة لا تزال تتسرب من الخلية ، فاسحب القطب الكهربائي ببطء وابحث عن خلية أخرى. من المهم ألا تتسرب الصبغة للحصول على نسبة إشارة / خلفية عالية في الصورة النهائية.
   5. انتظر لمدة 15 دقيقة تقريبا حتى تظهر الفروع والعمليات الدقيقة محددة ، وقم بإيقاف تشغيل الجهد واسحب طرف القطب برفق من الخلية.
3. صورة الخلية المملوءة.
   ملاحظة: يمكن إجراء التصوير مباشرة بعد التعبئة. ينتج عن الهدف ذو الفتحة العددية الأعلى (NA) دقة أفضل.
   1. انتظر حتى تعود الخلية إلى شكلها الأصلي قبل التصوير (15-20 دقيقة) بهدف 40x. لتصوير الخلية ، اضبط الإعداد على البؤر المتحد للتأكد من أن الفروع والعمليات الدقيقة تظهر محددة.
   2. قم بإعداد مكدس z بحجم خطوة 0.3 ميكرومتر. أثناء التصوير ، حرك الهدف حتى لا تكون هناك إشارة من الخلية وقم بتعيينه على أنه الأعلى. بعد ذلك ، حرك الهدف لأسفل (التركيز عبر الخلية) حتى لا تكون هناك إشارة ، اضبط ذلك على أنه الأسفل.

المواد