تصور تدفق الكالسيوم في الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط البطني المشتقة من أجنة الفئران

الملخص

المصدر: Bancroft, E. A., {{}}. القياس الكمي التلقائي Ca²⁺ التدفقات وتأثيراتها النهائية في الخلايا العصبية الأولية للفأر في منتصف الدماغ. J. Vis. Exp.. (2020)

{{TAG_ 46}} يوضح هذا الفيديو التصور في الوقت الفعلي لتدفق الكالسيوم في الخلايا العصبية البطنية في الدماغ المتوسط المشتقة من أجنة الفئران. باستخدام ناقل فيروسي للتعبير عن مؤشر الكالسيوم ، يتم تصوير الخلايا العصبية تحت مجهر متحد البؤر لتتبع التغيرات في شدة التألق أثناء نشاط الكالسيوم التلقائي والناقلات العصبية.

البروتوكول

1. طلاء الخلايا

NOTE: بناء على التجربة، يتم جمع حوالي 100,000 خلية قابلة للحياة لكل جنين. عادة ما يكون للفئران الحامل الموقوتة 2-3 أشهر أحجام قمامة من 8-10 أجنة؛ وبالتالي، فإن التقدير التقريبي لإجمالي الإنتاجية للخلايا لكل فأر حامل موقوت هو حوالي 1 مليون خلية.

1. باستخدام مقياس كثافة الدم، قم بإجراء تعداد الخلايا ثم قم بتخفيف التعليق إلى 2,000 خلية/ميكرولتر باستخدام وسط زراعة الخلايا. ثلاثي لفترة وجيزة للخلط.
2. قم بإزالة الغطاء بمحلول اللامينين من الحاضنة وشفط محلول اللامينين المتبقي من الغطاء المطلي باستخدام فراغ. قم بتركيب الألواح بسرعة لتجنب جفاف الأغطية تماما. ماصة 100 ميكرولتر (2.0 × 10⁵ خلايا / غطاء غطاء) على كل غطاء وضع أطباق بتري في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
3. أضف بعناية 3 مل من وسط زراعة الخلايا إلى كل طبق وضعه مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية. قم بتشكيل نصف متوسط يتغير مرتين في الأسبوع لمدة أسبوعين.

2. إصابة زراعة الخلايا في 14 (يوما في المختبر) DIV بالنواقل

1. الفيروسية المرتبطة بالغدة (AAV)لكل طبق قم بإعداد 1 مل من وسط DMEM الخالي من المصل مع 1 ميكرولتر من hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 × 10¹³ عيار)
2. استنشق وسط زراعة الخلايا من كل طبق واستبدله ب 1 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) الخالي من المصل (DMEM) الذي يحتوي على hSyn-GCaMP6f. ضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
3. استنشق الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على AAVs واستبدلها ب 3 مل من وسط زراعة الخلايا. ضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية. لقد وجدنا أن 5-7 أيام من عدوى AAV تسمح بمستويات مثالية من تعبير GCaMP. استمر في تغيير الوسط كل 2-3 أيام طوال هذه الفترة من العدوى الفيروسية.

3. التصوير الحي متحد البؤر Ca²⁺ بين 19-21 يوما في المختبر (DIV)

NOTE: يمكن إجراء التصوير بين 5-7 أيام بعد الإصابة الفيروسية. هذه هي النافذة المثالية لتحقيق التعبير المرئي عن الفلوروفور عند المستويات التي تسمح بالكشف عن نشاط Ca²⁺ التلقائي.

1. Preparation of recordings-stocks
   1. لعمل 1 لتر من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES ، أضف: 9.009 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.3728 جم من KCl ، 0.901 جم من D-glucose ، 2.381 جم من 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ، 2 مل من محلول مخزون 1 M CaCl₂ ، و 500 ميكرولتر من محلول مخزون 1 M MgCl₂ إلى 800 مل من H 2 المقطر المعقمO. ارفع الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. أحضر إلى الحجم النهائي 1 لتر.
   2. لعمل 200 مل من المخزن المؤقت لتسجيل الغلوتامات 20 ميكرومتر، قم بتخفيف 40 ميكرولتر من محلول مخزون الغلوتامات 100 ملي مولار إلى 200 مل من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES الموضح أعلاه.
2. التصوير
   1. متحد البؤراملأ طبق بتري معقم مقاس 35 مم بسعة 3 مل من المخزن المؤقت للتسجيل.
   2. قم بإزالة طبق بتري مقاس 35 مم مع الثقافات المصابة من الحاضنة 37 درجة مئوية. باستخدام ملقط رفيع ، أمسك بعناية حافة غطاء واحد وانقله بسرعة إلى طبق بتري المملوء بمخزن مؤقت للتسجيل. ضع الغطاء المتبقي في الوضع المتوسط مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية. انقل الطبق باستخدام المخزن المؤقت للتسجيل إلى المجهر متحد البؤر.
   3. ابدأ تشغيل برنامج التصوير. انتقل إلى الخطوة التالية أثناء تهيئتها.
   4. ابدأ تشغيل المضخة التمعجية وضع الخط في المخزن المؤقت للتسجيل. معايرة سرعة التدفق لتكون 2 مل / دقيقة.
   5. انقل الغطاء المصاب من طبق بتري مقاس 35 مم إلى حمام التسجيل.
   6. باستخدام هدف الغمر المائي 10x وضوء المجال الساطع (BF)، ابحث عن مستوى التركيز وابحث عن منطقة ذات كثافة عالية من أجسام الخلايا العصبية. قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء بمعدل 40 ضعفا واستخدم ضوء BF لإعادة تركيز العينة.
   7. في نافذة "قائمة الأصباغ" داخل FluoView حدد AlexaFluor 488 وقم بتطبيقه.
   8. AAV يمكن أن تكون متغيرة؛ لذلك، من أجل منع التعرض المفرط والتبييض الضوئي للفلوروفورات، ابدأ بإعدادات منخفضة HV وطاقة الليزر. بالنسبة لقناة AlexaFluor 488 ، اضبط الجهد العالي (HV) على 500 ، والكسب على 1x ، والإزاحة على 0. بالنسبة لخط الليزر 488 ، اضبط الطاقة على 5٪. لزيادة الحجم الفعال المصور في المستوى z ، قم بزيادة حجم الثقب إلى 300 ميكرومتر. استخدم خيار المسح الضوئي "التركيز × 2" لضبط إشارات الانبعاث على النحو الأمثل إلى مستويات التشبع الفرعي. من هنا ، يمكن ضبط الإعدادات حتى يتم تحقيق الرؤية المثالية لكل قناة.
      NOTE: لالتقاط النطاق الكامل لتدفقات Ca²⁺ بدقة باستخدام GCaMP، اضبط إعدادات HV وطاقة الليزر الأساسية للسماح بزيادة شدة الفلورسنت دون تشبع الكاشف.
   9. بمجرد تحسين إعدادات المجهر، حرك المسرح لتحديد موقع منطقة بها خلايا متعددة تعرض تغييرات تلقائية في مضان GCaMP6f والتركيز على المستوى المطلوب للتصوير.
   10. استخدم أداة "Clip rect" لقص إطار التصوير إلى حجم يمكنه تحقيق فاصل زمني للإطار أقل بقليل من 1 ثانية. يعد ذلك ضروريا لضبط الفاصل الزمني للتصوير عند 1 إطار في الثانية.
   11. اضبط نافذة "الفاصل الزمني" على قيمة 1.0 ونافذة "Num" على 600.
       NOTE: من أجل توفير مخازن تخزين مختلفة للتسجيل في النقطة الزمنية المطلوبة (300 ثانية)، من المهم معايرة زمن انتقال المضخة لتوصيل الحل الجديد إلى الحمام. سيعتمد هذا على معدل نضح المحلول (2 مل / دقيقة) وطول الخط المستخدم لضخ المحلول.
   12. لالتقاط فيلم من السلسلة t، حدد خيار "الوقت" ثم استخدم خيار المسح الضوئي "XYt" لبدء التصوير.
   13. شاهد شريط تقدم التصوير وانقل الخط من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES إلى المخزن المؤقت لتسجيل الغلوتامات 20 ميكرومتر في النقطة الزمنية المناسبة (على سبيل المثال، إذا تمت معايرة زمن انتقال المضخة لتقديم المحلول عند 60 ثانية، فقم بتحريك الخط إلى المخزن المؤقت للغلوتامات عند 240 إطارا من أجل توصيل الغلوتامات عند 300 ثانية).
   14. عند اكتمال التصوير، حدد الزر Series Done واحفظ فيلم t-series النهائي. استمر في تقويض 20 ميكرومتر من الغلوتامات لمدة 5 دقائق إضافية ، بحيث تعرضت الخلايا العصبية المستنبتة للغلوتامات لمدة 10 دقائق. كرر هذه العملية لكل قسيمة غلاف ليتم تصويرها.
   15. بعد التعرض الإضافي لمدة 5 دقائق ل 20 ميكرومتر من الغلوتامات ، قم بإزالة الغطاء من الحمام وضعه مرة أخرى في طبق بتري مقاس 35 مم الذي يحتوي على مخزن مؤقت للتسجيل حتى اكتمال يوم التصوير.

المواد