تصوير الكالسيوم في المختبر في مزارع الحصين قصيرة وطويلة المدى للفئران

الملخص

Source: < نمط الامتداد = '-webkit-text-decoration-skip: لا شيء؛ عائلة الخط: Arial، sans-serif؛ حجم الخط: 12pt؛ نمط الخط: عادي؛ متغير الخط: عادي؛ وزن الخط: 400؛ زخرفة النص تخطي الحبر: لا شيء؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس؛ المسافة البيضاء: التفاف المسبق؛ '>Calvo-Rodríguez، et al. التصوير الفلوري والتلألؤ الحيوي لنمط Ca = '-webkit-text-decoration-skip: none ؛ font-family: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 0.6em ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص - تخطي الحبر: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ '>^{2 +} < نمط الامتداد = '-webkit-text-decoration-skip: none ؛ عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ النص زخرفة تخطي الحبر: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ > في الخلايا العصبية في الحصين المسنين. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو استخدام التصوير الفلوري لقياس مستويات الكالسيوم العصاري الخلوي في مزارع الحصين قصيرة وطويلة المدى للفئران. من خلال مقارنة الخلايا العصبية الصغيرة والشيخوخة ، فإنه يسلط الضوء على كيفية زيادة كثافة قناة الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي من النوع L والتنشيط المطول في الخلايا العصبية المسنة يؤدي إلى زيادة الحمل على الكالسيوم ، وهي سمة مميزة لشيخوخة الخلايا العصبية. تكشف مؤشرات الكالسيوم الفلوري عن هذه الاختلافات من خلال التغيرات في شدة التألق عند التحفيز.

البروتوكول

1. ثقافة قصيرة وطويلة المدى للخلايا العصبية في الحصين الفئران

1. قم بتعقيم الأغطية الزجاجية بقطر 12 مم في الإيثانول لمدة 24 ساعة على الأقل.
2. ₂
3. Prepare 1.8 مل من محلول غراء (يتم شراؤه مباشرة) في قارورة (20 ميكرولتر / مل) في ظروف معقمة: للحصول على تركيز نهائي قدره 20 ميكرولتر / مل أضف حوالي 40 ميكرولتر من غراء في 1.8 مل من هانك بالإضافة إلى 0.6٪ ألبومين مصل بقري (BSA ، يجب حساب μl حسب ظروف المورد). يتم تحضير Hank's 0.6٪ BSA عن طريق خلط 85 مل من محلول الملح المتوازن من Hanks (HBSS) مع 15 مل من ألبومين مصل الأبقار بنسبة 4٪ (BSA ، محضر لحل 4 جم من BSA في 100 مل HBSS). قم بإعداده في غطاء معقم.
4. ₃₂Figure 1B²⁺ and Mg²⁺ plus 0.6٪ BSA وغسل أنسجة الحصين. بدون إزالة الوسائط ، قم بقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة (حوالي 2 × 2 مم) باستخدام نفس مقص العين.
5. ³ cells. يعتمد العدد الإجمالي للخلايا على عدد المستخدمة.

Over the four well multidish that تحتوي على 500 ميكرولتر من Neurobasal Culture Medium المحضرة من قبل وحفظها في الحاضنة, لوحة حول 30 × 10 cells in drop of about 50 μl to the all well of the multidish plate تحتوي على غطاء زجاجي مطلي بقطر 12 مم. style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>₂حاضنة لمدة 2-5 أيام in vitro2. التصوير الفلوري للكالسيموت الخلوي²⁺ Concentration

1. قم بإعداد محلول ملحي خارجي مخزن ب HEPES (HBS) يحتوي على مللي متر: NaCl 145, KCl 5, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, glucose 10, sodium-HEPES 10 (pH 7.42).
2. ^{2 +} < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ محاذاة رأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ محلول ملحي خال من > HEPES (HBS) يحتوي على ، في مللي متر: NaCl 146 ، KCl 5 ، CaCl ₂²⁺₂ 1, CaCl₂ 1, glucose 10 and HEPES 10 (pH 7.42).

خذ مزرعة الخلية التي تحتوي على أغطية من الحاضنة واغسلها بوسيط HBS في درجة حرارة الغرفة (RT) عن طريق نقلها إلى لوحة جديدة متعددة الأطباق بأربعة آبار تحتوي على 500 ميكرولتر من HBS لكل بئر. style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>^{2 +}

قم بتشغيل المصباح والمجهر ونظام التروية والكاميرا الفلورية والكمبيوتر.

note:

افتح ملف التجربة. باستخدام برنامج aquacosmos ، انقر فوق "النسبة" وحدد نطاق النسبة المطلوب. احسب نسبة بكسل تلو البكسل في الصور الناتجة للحصول على تسلسل من الصور النسبة.

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root = '1' data-sheets-baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Neurobasal Culture MediumGibco21103-049 HBSS mediumGibco14170-088 Ham's F-12 mediumGibco DNase I (from bovine pancreas)SigmaD5025-15KUFetal Bobine SerumLonzaDE14-801E < td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>B27Gibco17504-044 GentamicinGibco15750 L-glutamineGibco25030-032 12 mm glass coverslipsLabolan0111520/20012< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> PapainWorthingtonLS003127 4-well لوحات متعددة الأطباق<نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛'>Nunc < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> 176740 < نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛'> < نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ الحشو > أطباق بتري < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> دينار الكاتالونية s.l.2120044T Orbitile pipettesFisher Scientific431030< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Fura2-AMLife TechnologiesF1201 Lipofectamine2000Invitrogen11668-027 NMDASigma M3262 GlycineSigma50046< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Zeiss Axiovert S100 TV MicroscopeCarl Zeiss Inc. Xcite ilumination systemEXFO < td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> ORCA ER fluorescence cameraHamamatsu VC-8 valve controllerWarner Instruments SH-27B التدفئة نمط النظام Warner Instruments < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>Aquacosmos SoftwareHamamatsu Photonics < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>