تصور بروتين كيناز نشاط في الفأر باستخدام الفحص المجهري للتصوير الفلوري ثنائي الفوتون مدى الحياة

الملخص

المصدر: Jongbloets, B. C., . تصور بروتين كيناز نشاط في الفئران التي تتصرف برأس ثابت باستخدام الفحص المجهري للتصوير المضان ثنائي الفوتون في الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2019)

} يوضح هذا الفيديو إجراء فحص مجهري للتصوير مدى الحياة المضان ثنائي الفوتون لتصور نشاط بروتين كيناز A في الفئران التي تتصرف برأس ثابتة أثناء الحركة القسرية.

البروتوكول

1. In Vivo الفحص المجهري للتصوير المضان مدى الحياة ثنائي الفوتون

1. بدء التصوير المجهري مدى الحياة الفلورية ثنائية الفوتون (2pFLIM) في أو بعد أسبوعين من تثبيت نافذة الجمجمة. قلل من التداخل التجريبي الناتج عن الإجهاد عن طريق التعامل المتكرر مع الماوس وتجنيده قبل بدء دراسة التصوير لتعويد الماوس.
2. الشكل 1Cالشكل 1 ملاحظة: عدد الفوتونات المتكامل العملي في عائد الاستثمار للتصوير مدى الحياة لسوما إيجابي tAKARα في الجسم الحي هو ~1,000−10,000 فوتون اعتمادا على سعة الإشارة التي تنتج عن حافز معين.
   1. use reduced of view , reduce scanspeed senter, increase laser power, and increased number of frames to be averages لزيادة عدد الفوتونات المتكاملة وتقليل خطأ تقدير مدى الحياة. في الوقت نفسه ، تأكد من استخدام الحد الأدنى من طاقة الليزر الأساسية ، ومتوسط الإطار ، وسرعة المسح لتقليل التبييض الضوئي.
   2. 2. تحليل صور 2pFLIM

      1. افتح الصور المكتسبة في FLIMview وقم بتعيين المعلمات التالية في FLIMview.

      2. انقر فوق ر0 value field in FLIMview وأدخل t₀2. انقر فوق زر المجموعة الجديدة (N) وتعيين اسم مجموعة تجريبية. سيؤدي ذلك إلى إنشاء مجموعة تجمع البيانات من كل صورة FLIM مضافة.

      3. انقر فوق ROI زر في زر Roi Controlsz-stack Control4. انقر فوق الزر + لإضافة صورة FLIM إلى المجموعة (الخطوة 2.2). انقر فوق Calc6. حدد الملف deltaMPET / MPET₀ في القائمة المنسدلة لنمط Group Controls module. انقر فوق baseline# new start and enter the indexs (على سبيل المثال، 1 2 3 4 5₀). style='line-height:1.7999999999999999998;margin-bottom:0pt;margin-left:21.3pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>7. انقر فوق Plot لإنشاء رسم بياني يحتوي على استجابة FLIM (ΔLT/LT₀₀

النتائج

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مجهر ثنائي الفوتون	N/A	N/A
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	N/A
FLIMview MATLAB software	N/A	N/A
16x 0.. 8 NA غمر في الماء objective	Nikon	MRP07220
AnimalTracker MATLAB software	N/A	N/A
نظام المحاذاة التجسيمية	ديفيد kopf	1900
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyntAKARα-WPRE)	Addgene	119921
غطاء الرأس	N/A	N/A
N/A	N/A
غطاء دائري (قطر 5 مم)	r) VWR	101413-528

{{TAG_ 91}}حامل غطاء الرأس