مقالة منهجية

تصور ثلاثي الأبعاد لعدوى فيروس داء في أنسجة دماغ الفئران

مايو 29, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Zaeck, L., et al. تصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة لعدوى فيروس داء في أنسجة المخ التي تم تطهيرها بالمذيبات. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو عملية تحضير وتصوير أنسجة دماغ الفئران المصابة بفيروس داء (RABV) لتقييم تطور العدوى. يحدد الخطوات الرئيسية ، بما في ذلك تلطيخ الأنسجة بعلامات الفلورسنت ، والجفاف ، والتطهير ، والتركيب للفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ، ويبلغ ذروته في توليد تمثيل ثلاثي الأبعاد.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المناسبة.

تم استخدام مادة الدماغ المؤرشفة المثبتة بفيروس RABV وبارافورمالدهايد (PFA).

TAG_19} يستخدم هذا البروتوكول مواد سامة و / أو ضارة مختلفة ، بما في ذلك PFA والميثانول (MeOH) وبيروكسيد الهيدروجين (H2O2) ، أزيد الصوديوم (NaN 3} TAG_40{{}}TAG_41} [{TAG_43}}-بوتانول (TBA) ، كحول البنزيل (BA) ، بنزوات البنزيل (BB) ، وإثير ثنائي الفينيل (DPE). MeOH و TBA قابلان للاشتعال بدرجة كبيرة. تجنب التعرض عن طريق ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والقفازات وحماية العين) وإجراء التجارب في غطاء الدخان. جمع النفايات بشكل منفصل في حاويات مناسبة والتخلص منها وفقا للوائح المحلية. يصنف فيروس داء على أنه مسببات الأمراض بمستوى السلامة البيولوجية (BSL) -2 ، وبالتالي يمكن التعامل معه بشكل عام في ظل ظروف BSL-2. قد تتطلب بعض الأنشطة ، بما في ذلك الإجراءات التي قد تولد الهباء الجوي ، أو تعمل بتركيزات عالية من الفيروسات ، أو تعمل مع فيروسات الحالة الجديدة ، تصنيف BSL-3. يوصى بالوقاية قبل التعرض للأفراد المعرضين لمخاطر عالية ، بما في ذلك القائمين على رعاية والعاملين في المختبرات. راجع لوائح السلطة المحلية.

1. تثبيت أنسجة المخ والتقطيع

  1. إصلاح عينات الدماغ بحجم مناسب من 4٪ PFA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS [درجة الحموضة 7.4]) لمدة 48 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية (مع نسبة تقريبية من الأنسجة إلى المثبت تبلغ 1:10 [v / v]).
  2. اغسل عينات المناديل 3x في PBS لمدة 30 دقيقة على الأقل لكل غسلة وقم بتخزينها في 0.02٪ NaN 3 / PBS عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. قسم الأنسجة إلى أقسام بسمك 1 مم باستخدام اهتزاز (معدل تغذية الشفرة: 0.3-0.5 مم / ثانية ، السعة: 1 مم ، سمك الشريحة: 1,000 ميكرومتر).
  4. للاحتفاظ بتسلسل الشرائح الصحيح ، قم بتخزين كل قسم من أقسام الأنسجة على حدة في بئر من لوحة زراعة الخلايا متعددة الآبار. أضف 0.02٪ NaN3 / PBS وقم بتخزين أقسام المناديل في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

2. عينة من المعالجة المسبقة بالميثانول

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الحضانة بتذبذب لطيف ، وإذا لم يذكر خلاف ذلك ، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. تخدم المعالجة المسبقة للعينة الغرض العام المتمثل في تحسين انتشار الأجسام المضادة وتقليل التألق الذاتي للأنسجة عن طريق التعرض ل MeOH و H2O 2 ، على التوالي.

  1. تحضير محاليل 20٪ (حجم / حجم) و 40٪ و 60٪ و 80٪ MeOH في الماء المقطر. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 20٪ MeOH ، أضف 10 مل من MeOH بنسبة 100٪ إلى 40 مل من الماء المقطر في وعاء مناسب قابل للغلق واخلطه عن طريق قلبه.
  2. نقل العينات إلى أوعية ذات حجم معقول (على سبيل المثال ، أنابيب تفاعل 5 مل). احرص على استخدام مواد مقاومة كيميائيا للكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. على سبيل المثال ، لاحظ أنه في حين أن البولي بروبيلين مناسب ، فإن البوليسترين ليس كذلك.
    ملاحظة: تشير مواصفات الحجم في هذا البروتوكول إلى أنابيب تفاعل سعة 5 مل. إذا تم استخدام وعاء مختلف ، فاضبط الأحجام وفقا لذلك.
  3. احتضان العينات في 4 مل من كل تركيز من السلسلة المحضرة من محاليل MeOH بترتيب تصاعدي لمدة 1 ساعة لكل منها.
  4. احتضان العينات 2x لمدة ساعة لكل منها في MeOH نقي (100٪).
  5. قم بتبريد العينات إلى 4 درجات مئوية (على سبيل المثال ، في ثلاجة آمنة للمختبر).
  6. تحضير محلول التبييض (5٪ H2O2{ في MeOH) عن طريق ، على سبيل المثال ، تخفيف 30٪ H2O{2 محلول الأسهم عند 1:6 بوصة نقي (100٪) MeOH ، وقم بتبريده عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة MeOH بنسبة 100٪ من العينات المبردة وأضف 4 مل من محلول التبييض المبرد مسبقا (5٪ H2O 2 في MeOH). احتضن بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  8. استبدل محلول التبييض ب 4 مل من 80٪ MeOH واحتضنه لمدة 1 ساعة. استمر في استخدام السلسلة المحضرة من محاليل MeOH بترتيب تنازلي لمدة 1 ساعة لكل منها حتى يتم تحضين العينات لمدة ساعة واحدة في 4 مل من 20٪ MeOH.
  9. اغسل العينات 1x لمدة 1 ساعة باستخدام 4 مل من PBS.

3. تلطيخ المناعة

} ملاحظة: { قم بتنفيذ جميع خطوات الحضانة بتذبذب لطيف ، وإذا لم يذكر خلاف ذلك ، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. لمنع نمو الميكروبات ، أضف NaN 3 إلى تركيز نهائي قدره 0.02٪ إلى المحاليل الموجودة في هذا القسم. يتم اختراق عينات الأنسجة بشكل أكبر عن طريق العلاج بالمنظفات غير الأيونية Triton X-100 و Tween 20. يستخدم المصل العادي لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد. يضاف الجلايسين والهيبارين لتقليل خلفية الملصقات المناعية.

  1. اغسل العينات 2x لمدة ساعة واحدة في 4 مل من 0.2٪ Triton X-100 / PBS.
  2. تخلل العينات لمدة يومين عند 37 درجة مئوية مع 4 مل من 0.2٪ تريتون X-100 / 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) / 0.3 م جلايسين / PBS.
  3. منع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة عن طريق احتضان العينات لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في 4 مل من 0.2٪ Triton X-100 / 10٪ DMSO / 6٪ مصل عادي / PBS.
    ملاحظة: استخدم مصلا عاديا من نفس النوع الذي تم رفع الجسم المضاد الثانوي فيه لتحقيق نتائج حجب مثالية.
  4. احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية (3٪ مصل عادي / 5٪ DMSO / PTwH [PBS-Tween 20 مع الهيبارين] + الأجسام المضادة الأولية / الأجسام المضادة) لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية. قم بتحديث محلول الأجسام المضادة الأولية بعد 2.5 يوم.
    1. بالنسبة ل PTwH ، أعد تكوين ملح الصوديوم الهيبارين في الماء المقطر لعمل محلول مخزون 10 مجم / مل (قم بتخزين هذا المحلول ، مقتبس ، عند 4 درجات مئوية). أضف محلول المرق إلى 0.2٪ Tween 20 / PBS إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: قد يتطلب اختيار تخفيف الجسم المضاد الصحيح تحسينا. بشكل عام ، تعد تركيزات الكيمياء المناعية القياسية نقطة انطلاق جيدة.
  5. اغسل العينات لمدة يوم واحد في 4 مل من PTwH ، وقم باستبدال المخزن المؤقت للغسيل لمدة 4x-5x على الأقل خلال النهار واترك الغسيل النهائي طوال الليل.
  6. احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية (3٪ مصل عادي / PTwH + أجسام مضادة ثانوية / أجسام مضادة) لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية. قم بتحديث محلول الأجسام المضادة الثانوية بعد 2.5 يوم.
    1. تمييع الأجسام المضادة / الأجسام المضادة الثانوية عند 1: 500 في محلول الأجسام المضادة الثانوية (أي 4 ميكرولتر في 2 مل).
  7. اغسل العينات لمدة يوم واحد كما هو موضح في الخطوة 3.5 ، مع ترك الغسيل النهائي طوال الليل.

4. تلطيخ نووي

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الحضانة بتذبذب لطيف ، وإذا لم يذكر خلاف ذلك ، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. إذا لم يكن هناك حاجة إلى تلطيخ نووي أو إذا كان الطول الموجي / طيف الانبعاث للإثارة من الثيازول الأحمر (TO-PRO-3) مطلوبا لإثارة أو اكتشاف فلوروفور آخر ، فتخط هذه الخطوة.

  1. قم بتخفيف صبغة الحمض النووي TO-PRO-3 عند 1: 1,000 في PTwH واحتضان العينات في 4 مل من محلول التلوين النووي لمدة 5 ساعات.
  2. اغسل العينات لمدة يوم واحد كما هو موضح في الخطوة 3.5 ، مع ترك الغسيل النهائي طوال الليل.
    ملاحظة: بعد الغسيل ، يمكن تخزين العينات في PBS عند 4 درجات مئوية حتى المقاصة البصرية.

5. تنظيف الأنسجة

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الحضانة بتذبذب لطيف ، وإذا لم يذكر خلاف ذلك ، في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء. يتم تجفيف عينات الأنسجة في سلسلة متدرجة من محاليل TBA. نظرا لأن التلوين المناعي يتطلب محاليل مائية ، يجب الانتهاء من جميع إجراءات التلوين قبل إزالة الأنسجة. يتم تحقيق التخليص البصري ومطابقة معامل الانكسار عن طريق العلاج بمزيج من BA و BB و DPE. يتم استكمال محلول المقاصة ب DL-α-tocopherol كمضاد للأكسدة.

  1. تحضير محاليل 30٪ (حجم / حجم) و 50٪ و 70٪ و 80٪ و 90٪ و 96٪ TBA في الماء المقطر. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 30٪ TBA ، أضف 15 مل من TBA بنسبة 100٪ إلى 35 مل من الماء المقطر في وعاء مناسب قابل للغلق واخلطه عن طريق قلبه.
    ملاحظة: TBA لديه نقطة انصهار 25-26 درجة مئوية. وبالتالي ، فإنه يميل إلى أن يكون صلبا في درجة حرارة الغرفة. لتحضير محاليل TBA ، قم بتسخين الزجاجة محكمة الغلق عند 37 درجة مئوية في حاضنة أو حمام مائي.
  2. تجفيف العينات ب 4 مل من كل تركيز من السلسلة المحضرة من محاليل TBA بترتيب تصاعدي لمدة 2 ساعة لكل منها. اترك 96٪ TBA بين عشية وضحاها.
  3. قم بتجفيف العينات بشكل أكبر في مادة نقية (100٪) TBA لمدة ساعتين.
  4. تحضير محلول المقاصة BABB-D15.
    ملاحظة: BABB-D15 عبارة عن مزيج من BA و BB (BABB) يتم خلطه مع DPE بنسبة x:1 ، حيث يتم تحديد x في اسم الحل ، في هذه الحالة 15.
    1. بالنسبة إلى BABB ، امزج جزءا واحدا من مكتبة الإسكندرية مع جزأين BB.
    2. امزج BABB و DPE بنسبة 15: 1.
    3. أضف 0.4٪ حجمي DL-α-توكوفيرول (فيتامين ه).
      ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة ل 20 مل من BABB-D15 ، امزج 6.25 مل من BA مع 12.5 مل من BB. أضف 1.25 مل من DPE واستكمله ب 0.08 مل من DL-α-tocopherol.
  5. قم بتنظيف العينات في محلول المقاصة حتى تصبح شفافة بصريا (2-6 ساعات).
  6. يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية في BABB-D15 ، محمية من الضوء ، حتى التركيب والتصوير.

6. تركيب العينة

  1. باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد ، اطبع غرفة التصوير والغطاء (المادة: البوليستر المشترك [CPE] ، الفوهة: 0.25 مم ، ارتفاع الطبقة: 0.06 مم ، سمك الجدار: 0.88 مم ، عدد الجدار: 4 ، الحشو: 100٪ ، لا يوجد هيكل دعم).
  2. قم بتجميع غرفة التصوير ( الشكل 1).
    1. قم بتركيب غطاء دائري (قطر: 30 مم) على غرفة التصوير باستخدام مطاط السيليكون RTV-1 (فلكنة بدرجة حرارة الغرفة أحادية المكون). قم بإزالة مطاط السيليكون الزائد بقطعة قطن مبللة بالماء وقم بمعالجتها طوال الليل.
    2. قم بتركيب غطاء دائري (قطر: 22 مم) على الغطاء بمطاط السيليكون RTV-1. قم بإزالة مطاط السيليكون الزائد بقطعة قطن مبللة بالماء وقم بمعالجتها طوال الليل.
  3. ضع العينة في غرفة التصوير ، وأضف حجما صغيرا من BABB-D15 ، وأدخل الغطاء. املأ الغرفة ب BABB-D15 من خلال المدخل ، باستخدام إبرة تحت الجلد (27 جم × 3/4 بوصة [0.40 مم × 20 مم]).
  4. قم بتوصيل المدخل وأغلق غرفة التصوير بمطاط السيليكون RTV-1. عالج بين عشية وضحاها في الظلام.

7. التصوير ومعالجة الصور

  1. قم بإعداد الحصول على الصورة عن طريق تحديد خطوط الليزر المعنية لتتناسب مع الفلوروفورات المستخدمة. اضبط نطاقات الكشف لكل كاشف لمنع تداخل الإشارة بين القنوات.
    ملاحظة: نطاقات الكشف المثالية ل Alexa Fluor 488 و Alexa Fluor 568 و TO-PRO-3 هي 500-550 نانومتر و 590-620 نانومتر و 645-700 نانومتر على التوالي.
  2. اختر معلمات الاكتساب ، وحدد الحد العلوي والسفلي ل z-stack ، واحصل على مكدس الصور.
    ملاحظة: معلمات الاستحواذ النموذجية هي مسح متسلسل بحجم بكسل 60-90 نانومتر ، وحجم خطوة z يبلغ 0.5 ميكرومتر ، ومتوسط خط 1 ، وسرعة مسح 400 هرتز ، وحجم ثقب 1 وحدة متجددة الهواء.
  3. قم بمعالجة مكدس الصور باستخدام برنامج تحليل الصور المناسب (على سبيل المثال ، فيجي) لإنشاء إسقاطات ثلاثية الأبعاد أو إجراء تحليلات متعمقة.
    ملاحظة: نظرا للحجم الكبير لملفات الصور المكتسبة ، عادة ما يكون استخدام محطة العمل ضروريا.
    1. افتح ملف (ملفات) الاستحواذ أو الصورة في فيجي (ملف |{ {TAG_589}} افتح | حدد الملفات).
      1. إذا كنت تستخدم، على سبيل المثال، ملفات LIF، فحدد الخيارات المطلوبة أو ألغ تحديدها في نافذة الحوار Bio-Formats. عرض المكدس باستخدام Hyperstack. بخلاف ذلك ، لا توجد اختيارات محددة أو علامات ضرورية. اضغط على OK.
      2. إذا كان الملف يحتوي على مكدسات صور متعددة، فحدد تلك المراد تحليلها وقم بتأكيدها بالضغط على OK.
    2. قم بإجراء تصحيح التبييض عن طريق تقسيم الصورة المدمجة إلى قنوات فردية ( صورة |{ {TAG_645}} اللون | أداة القنوات، ثم اختر المزيد | ). لكل قناة، حدد تصحيح التبييض ( صورة | اضبط | {{TAG_683 TAG_684}}} واختر النسبة البسيطة (كثافة الخلفية: 0.0).
      ملاحظة: TAG_699 في بعض الحالات ، على سبيل المثال ، عندما لا يكون هناك اضمحلال خطي للإشارة أو تكون الإشارة ضعيفة جدا بشكل عام ، قد تفشل النسبة البسيطة . بدلا من ذلك ، جرب الملاءمة الأسية أو تخطي تصحيح التبييض.
    3. اضبط السطوع والتباين لكل قناة باستخدام أشرطة التمرير ( صورة |{ {TAG_724}} اضبط | السطوع | التباين).
    4. دمج القنوات ( صورة |{ {TAG_754}} اللون | دمج القنوات) ، اصنع مركبا ( صورة | {{TAG_776 TAG_775}}| أداة القنوات, ثم حدد المزيد | اصنع مركبا) ، وقم بتحويله إلى تنسيق RGB ( صورة | اللون | {} القنوات أداة ، ثم حدد المزيد | التحويل إلى RGB).
    5. إذا لزم الأمر، قم بتغيير حجم مكدس الصور لتقليل وقت الحساب وحجم الملف ( صورة | اضبط | الحجم, تم وضع علامة على كلا الخيارين بالإضافة إلى الاستيفاء ثنائي الخط).
    6. قم بإنشاء إسقاط ثلاثي الأبعاد ( صورة | {{TAG_865 TAG_866}}| ). اختر النقطة الأكثر سطوعا كطريقة عرض واضبط تباعد الشرائح لتتناسب مع حجم الخطوة z لمكدس الصور المكتسبة. للحصول على أقصى قدر من الجودة، اضبط زيادة زاوية الدوران على 1 وقم بتمكين الاستيفاء. قم بتعديل إجمالي الدوران وعتبات الشفافية والتعتيم حسب الحاجة.
    7. إذا لزم الأمر، أعد ضبط التباين والسطوع عن طريق تحويل الإسقاط ثلاثي الأبعاد مرة أخرى إلى تنسيق 8 بت ( صورة | { اكتب | 8 بت). استخدم أشرطة التمرير المعنية ( صورة | TAG_919{{}}| السطوع | التباين) وأعد تحويل مكدس الصور إلى تنسيق RGB كما هو موضح في الخطوة 7.3.4.
    8. احفظ الإسقاط ثلاثي الأبعاد ك . ملف TIF (تنسيق ملف الصورة) وملف .AVI (تنسيق ملف الفيديو).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root='1' data-sheets-baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ colspan = '4' rowspan = '1' >Reagents benzyl alcohol< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space : normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>Alfa Aesar < td style = 'overflow: مخفي ؛ حشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة رأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> 41218 < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ '> كاشف المقاصةBenzyl benzoateSigma-AldrichBB6630-500ML< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> Clearing Reagentdimethyl sulfoxideCarl Roth4720.2 مخازن مؤقتة مختلفةDiphenyl etherSigma-Aldrich240834-100G< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> Clearing ReagentDL-α-TocopherolAlfa AesarA17039 مضادات الأكسدةDonkey serumBio-RadC06SBZ< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> حجب كاشفGlycineCarl Roth3908.2 Background ReductionGoat SerumMerckS26-100ML< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> حجب كاشفHeparin sodium saltCarl Roth7692.1 Background Reduction Hydro-Peroxide Solution (30٪)Carl Roth8070.2< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> Sample bleachingMethanolCarl Roth4627.4< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> عينة المعالجة المسبقةParaformaldehydeCarl Roth335.3 Crystalline Powder to Make Fix solutionSodium azideCarl RothK305.1< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> منع النمو الميكروبي في حلول المخزونtert-ButanolAlfa Aesar33278< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> عينة من الجفاف لإزالة الأنسجةto-PRO-3Thermo FisherT3605< td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> بقعة الحمض النوويTriton X-100Carl Roth3051.2< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;a-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> DetergentTween 20AppliChemA4974,0500< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;a-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> DetergentMiscellaneous5 mL أنابيب تفاعل< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>Eppendorf < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>30119401 نماذج من الأنابيب<نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> غطاء ، دائري (القطر: 22 مم) < نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>Marienfeld < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ > 111620< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> part of the imaging chamberCoverslip, دائري (القطر: 30 مم)Marienfeld111700part of imaging chamberLat-Edic (27 G x 3/4 "[0.40 مم × 20 مم])< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>B. Braun4657705 < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>ملء غرفة التصوير بمحلول المقاصة < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> RTV-1 مطاط السيليكون < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> Wacker < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> Elastosil E43< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> لاصق لتجميع غرفة التصويرUltimaker CPE 2.85 mm شفافUltimaker8718836374869 copolyster filament للطابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة أجزاء من غرفة التصويرTechnical and Software<tr style='height:21px;' >< td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4؛ '>3D printerUltimakerUltimaker 2+ +< td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> طباعة غرفة التصويرAutomated Water Soak SystemLeica15640019< td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> مضخة مياه يتم التحكم فيها بواسطة البرامجBenchtop Benchtop orbital shakerElmiDOS-20M< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> عينة حضانة في درجة حرارة الغرفة (~ 150 دورة في الدقيقة)Benchtop Benchtop orbital shaker, heatedNew Brunswick Scientific<نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> G24 شاكر البيئي < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>حضانة عينة عند 37 درجة مئوية (~ 150 دورة في الدقيقة) < نمط tr = 'الارتفاع: 21 بكسل ؛ '>< نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر< td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>Leica < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>DMI 6000 TCS SP5 < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> مقلوب متحد البؤر مجهر لتصوير العينةFijiNIH (ImageJ) open source software (v1.52h) Image processing package based on ImageJLeica < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة كسر ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>15506360 < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة كسر ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> HC PL APO 40x / 1.10 W motCORR CS2الاهتزازLeicaVT1200S Sample SsliceWorkstationDellPrecision 7920CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TBPrimary antibodies goatgoat anti-RABV N مصل الماعز متعدد النسيلة أحادي النوع المضاد ل RABV N ، الناتج عن تحصين الماعز باستخدام البروتين النووي RABV المعبر عنه بفيروس الباكولوبروتين N = 'الارتفاع: 21 بكسل ؛'> diltion: 1:400< td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word ؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> Rabbit anti-GFAP < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '>DakoZ0334body antibody polyclonal (RRID:AB_10013382) diltion: 1:100<نمط td = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> الأرنب المضاد ل MAP2 < td النمط = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>Abcam < td style = 'overflow: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كسر الكلمة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ >ab32454body antibody polyclonal (RRID:AB_776174) diltion: 1:250< td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom؛ white-space: normal؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> Rabbit anti-RABV P 160-5Friedrich-Loeffler-Institut مصل أرنب متعدد النسيلة أحادي النوع مضاد ل RABV P ، تم إنشاؤه عن تحصين الأرانب باستخدام البروتين الفوسفي RABV المعبر عنه بواسطة الفيروس العصبي ومنقى His Tag P (انظر المرجع 23: Orbanz et al. ، 2010) diltion: 1:1,000الأجسام المضادة الثانويةDonkey anti-goat IgG اعتمادا على الفلوروفور المترافق < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ white-space: normal ؛ word-wrap: break-word؛ wrap-strategy: 4 ؛ '> Highly cross-absorbed diltion: 1:500< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>donkey anti-mouse IgGThermo Fisher Scientific اعتمادا على مترافق fluorophoreCross-absorbed diltion: 1:500donkey anti-rabbit IgGThermo Fisher Scientificاعتمادا على الفلوروفور المترافق < نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمة : كلمة الكسر ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> نمط الامتصاص المتقاطع للغاية < tr = 'الارتفاع: 21 بكسل ؛ '>< نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> نمط < TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < نمط TD = 'الفائض: مخفي؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛> diltion: 1:500goat anti-mouse IgGThermo Fisher Scientificاعتمادا على الفلوروفور المترافق < نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمة : كلمة الكسر ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> نمط الامتصاص المتقاطع للغاية < tr = 'الارتفاع: 21 بكسل ؛ '>< نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> نمط < TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < نمط TD = 'الفائض: مخفي؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛> diltion: 1:500goatgoat anti-rabbit IgGThermo Fisher Scientificاعتمادا على الفلوروفور المترافق < نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمة : كلمة الكسر ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> نمط الامتصاص المتقاطع للغاية < tr = 'الارتفاع: 21 بكسل ؛ '>< نمط TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> نمط < TD = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < نمط TD = 'الفائض: مخفي؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛> diltion: 1:500

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Rabies Virus InfectionMouse Brain TissueConfocal Laser Scanning MicroscopyThree Dimensional VisualizationTissue ClearingFluorescent StainingImmunostaining ProtocolSolvent ClearingImage Acquisition3D Projection

مقالات ذات صلة