تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المناسبة.
1. المعايرة
- قم بتشغيل المجهر قبل ساعة واحدة على الأقل من التصوير للسماح بالتثبيت الحراري لمصدر الليزر (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج المسح الطيفي (انظر جدول المواد) وانقر فوق الزر Acquisition في الجزء العلوي من واجهة المستخدم الرسومية (واجهة المستخدم الرسومية) ( الشكل 1 أ ).
- قم بتشغيل غالق البرنامج لليزر ذو الضوء الأبيض (WLL) وأنبوب المضاعف الضوئي (PMT) ( الشكل 1 أ).
- حدد وضع xyΛ في القائمة المنسدلة في وضع الاستحواذ ، ثم يتم تغيير وضع إدخال الليزر تلقائيا من النسبة المئوية الثابتة إلى الطاقة الثابتة. قم بإلغاء تحديد خانة الاختيار Automatic SP Movement. بعد ذلك ، اضبط النافذة الطيفية لليزر المدخل على 470-670 نانومتر وحجم الخطوة الطيفية على 4 نانومتر في إعدادات مسح Λ-Excitation Lambda ( الشكل 1 ب ).
- اضبط النطاق الطيفي ل PMT على 450-690 نانومتر عن طريق النقر المزدوج أو تحريك شريط الضبط للنطاق الطيفي ( الشكل 1c ).
ملاحظة: يجب أن يتضمن هذا النطاق الطيفي النطاق الترددي الكامل لمصدر الإدخال. - حدد عدسة موضوعية بالغمر في الماء ، بشكل مناسب بفتحة عددية عالية (NA > 0.7) وأعط أي قيمة ل PMT وطاقة الليزر لتنشيط AOBS ( تكوين وزر المسح المباشر. قم بتبديل المسار البصري عن طريق التحقق من الانعكاس في تكوين AOBS ( الشكل 1d).
- قم بتركيب مرآة مرجعية (انظر جدول المواد) على مرحلة المجهر. يجب أن يكون سطح المرآة مواجها للعدسة الموضوعية. إذا لم يكن من السهل تركيب المرآة على مرحلة المجهر ، فقم بربط مرآة على لوحة مسطحة ( على سبيل المثال ، زجاج منزلق).
- تحكم في مرحلة المجهر لمحاذاة المستوى البؤري مع سطح المرآة.
- اضبط كسب PMT وطاقة الليزر ، مع مراعاة النطاق الديناميكي للكاشف ، ثم قم بتغيير وضع إدخال الليزر من النسبة المئوية الثابتة إلى الطاقة الثابتة.
ملاحظة: كما هو معتاد ، يتم استخدام كسب PMT قدره 500 (V) وقوة ليزر نسبية تبلغ 0.1٪ عند 570 نانومتر. - قم بالتأكيد في وضع الألوان الزائفة للتحقق من عدم وجود تشبع في جميع أنحاء نطاق الطول الموجي. إذا لوحظ التشبع ، فقم بخفض طاقة الليزر (الشكل 1 أ).
- قم بتشغيل الاستحواذ على Lambda Scan
- قم بإزالة المرآة من المسرح وكرر نفس عملية الاستحواذ بدون عينة من أجل الحصول على المرجع المظلم ( أي ، الإزاحة المظلمة).
- احفظ البيانات بتنسيق TIF متعدد المكدسات.
2. SpeRe (قياس الانعكاس الطيفي) الحصول على الصور
- ضع الأنسجة المثبتة على مرحلة المجهر. لمحاذاة الأنسجة تقريبا مع المستوى البؤري للعدسة الشيئية ، استخدم وضع التألق واسع المجال من خلال عدسة العينية.
- مع تشغيل المسح المباشر، تحكم في مرحلة المجهر لمحاذاة المستوى البؤري مع المنطقة ذات الاهتمام في الأنسجة. لتجنب ضوضاء الخلفية من الغطاء ، حدد المنطقة المستهدفة بعمق 15 ميكرومتر على الأقل من واجهة الأنسجة الزجاجية.
- الحصول على مكدس الصور الطيفية للمنطقة المستهدفة باستخدام نفس الإجراء الموضح في الخطوات 1.1-1.10.
- احفظ البيانات للأنسجة والإزاحة الداكنة بتنسيق Multistacked TIF.
ملاحظة: قد يتوقف المجرب مؤقتا في هذه المرحلة.
3. معالجة الصور وتحليلها
- افتح البيانات الطيفية (TIF متعدد المكدسات) للمرآة المرجعية وأنسجة المخ في ImageJ.
- حدد عائد الاستثمار (مناطق الاهتمام) لمكدسات الصور المفتوحة - المنطقة المركزية للمرآة المرجعية وجزء من ألياف محورية لأنسجة الدماغ.
- احصل على الأطياف الأولية لعائد الاستثمار المحدد عن طريق تشغيل Image → المكدسات → ملف تعريف المحور Z في قائمة ImageJ.
- افتح بيانات الإزاحة المظلمة ، أحدها مأخوذ للمرآة المرجعية والآخر مأخوذ لأنسجة المخ.
- احصل على أطياف الإزاحات المظلمة عن طريق تشغيل Image → → ملف تعريف المحور Z في قائمة ImageJ.
- احفظ جميع الأطياف المكتسبة باستخدام خيارات النسخ واللصق .
ملاحظة: بالنسبة للتصوير SpeRe، يوصى باستخدام مجال التصوير المركزي لتقليل الانحرافات البصرية خارج المحور. قد تكون ألياف المحور العصبي غير متجانسة هيكليا على طولها. ومن ثم ، يوصى باختيار عائد الاستثمار على مقطع محوري صغير ، عادة < 5 ميكرومتر ، لتقليل القطعة الأثرية ذات الحجم الجزئي.
