تصور إسقاطات الخلايا العصبية الحركية وتفرع المحاور العصبي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة

الملخص

Source: Liau, E. S. et al. تصور الملاحة المحورية الحركية والقياس الكمي للتعجير المحوري في أجنة الفأر باستخدام الفحص المجهري الفلوري للورقة الخفيفة. J. Vis. Exp.يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري الفلوري للورقة الضوئية لتصوير إسقاطات الخلايا العصبية الحركية وتفرع المحور العصبي في أجنة الفئران المعدلة وراثيا. يحدد الخطوات المتبعة في إعداد العينة والتصوير وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد للتفرع المحوري لتقييم نمو الخلايا العصبية الحركية والاتصال.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات من والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

1. الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة (LSFM) (2-3 ساعات)

1. إعداد العينة
   1. إعداد بصريات الإضاءة 5X/0.1 وبصريات الكشف 5X/0.16. قم بتجميع حامل العينة والعينة الشعرية (القطر الداخلي 1.5 مم ، أخضر) ووضعها في المجهر.
      ملاحظة: ارجع إلى دليل تشغيل المجهر للحصول على إجراءات إعداد مفصلة.
   2. قم بتركيب الجنين على النحو التالي:
      1. قم بإعداد طرف الماصة P200 عن طريق قطع الجزء العلوي بحيث يناسب قطر الشعيرات الدموية وإزالة الجزء المدبب (~ 3 مم) لمرفق العينة.
      2. قم بإذابة الطرف الضعيف لطرف الماصة باستخدام لهب صغير.
      3. أطفئ اللهب وقم بإرفاق الجنين بسرعة عموديا على الطرف الذائب.
      4. قم بتركيب الجزء العلوي من طرف الماصة مع العينة الشعرية.
   3. اسمح للمخزن المؤقت للغرفة بالتوازن مع الجنين لمدة 1 دقيقة لإزالة الحطام أو الفقاعات.
   4. باستخدام برنامج التصوير، حدد حدد موقع الشعيرات الدموية ضمن حدد موقع علامة التبويب واضبط المحاور x وy وz لوضع العينة الشعرية.
   5. حدد حدد موقع العينة والتكبير إلى 0.6X للتركيز على الجنين. قم بتدوير الجنين للتأكد من أن المحور الطويل للطرف المصور يتماشى مع مسار الضوء لمصدري الضوء ( الشكل 1 ب).
2. الحصول على الصور
   1. تحت الاستحواذ ، حدد معلمات مسار الضوء مثل أهداف الكشف ومرشح حجب الليزر وفاصل الشعاع والكاميرات والليزر.
      ملاحظة: يتم استخدام قناة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في هذه التجربة (الطول الموجي للإثارة: 488 نانومتر ؛ مرشح الانبعاث: ممر النطاق (BP) 505 إلى 545 نانومتر ؛ مقسم الشعاع: SPS LP 560).
   2. حدد خانة الاختيار المسح المحوري لتقليل الظل.
   3. تحديد إعدادات الاستحواذ: عمق البت, 16 بت; تكبير ، 0.36-0.7X ؛ إضاءة أحادية الجانب (يسار / يمين) أو إضاءة مزدوجة الجانب.
   4. انقر فوق مستمر واضبط شدة الليزر ووقت التعرض وقوة الليزر وموضع ورقة الضوء للحصول على صور أكثر وضوحا.
      ملاحظة: يتم الاحتفاظ بقوة الليزر منخفضة قدر الإمكان لتقليل التلف الضوئي.
   5. اضغط على STOP لإنهاء الحصول على الصور.
3. اكتساب متعدد الأبعاد
   1. حدد المكدس z عن طريق تحريك موضع Z للصورة الأولى والأخيرة. انقر فوق لتعيين رقم الشريحة.
   2. انقر فوق بدء التجربة للحصول على z-stack المحدد.
   3. عند الانتهاء ، احفظ الصورة بتنسيق .czi.
4. معالجة الصور (اختياري)
   1. {{}}تابع الاندماج المزدوج الجانب تحت القناة {{}} معالجة الورقة الضوئية {{}} إذا تم تطبيق الإضاءة المزدوجة. معالجة متعددة المشاهدات{ضروري إذا تم الحصول على طرق عرض متعددة لدمج الصور من زوايا متعددة.
   2. أنشئ صورة ثنائية الأبعاد باستخدام بيانات من وحدات البكسل الأعلى كثافة على طول محور الإسقاط أسفل قناة الإسقاط الأقصى للكثافة.
   3. ضمن قناة نسخ، انقر فوق { المجموعة الفرعية لتحديد مجموعات فرعية من الصور من المجموعة الأصلية.

2. القياس الكمي لتحكيم المحور العصبي (30 دقيقة لكل عصب فردي)

1. افتح ملف الصورة في برنامج تحليل التصوير (بشكل افتراضي ، يتم فتح الصورة التي تحتوي على بيانات XYZ في وضع تجاوز وكعرض ثلاثي الأبعاد).
2. اضبط لون الصورة وسطوعها وتباينها باستخدام نافذة تعديل العرض ( تعديل | إظهار ضبط العرض) للكشف عن الخيوط بناء على تباين الشدة المحلية.
3. انقر فوق أيقونة إضافة خيوط جديدة وحدد خوارزمية المسار التلقائي (بدون حلقة) في القائمة المنسدلة.
4. حدد منطقة الاهتمام (في هذه الحالة، محور الأهمية المجزأ). انقر فوق التالي عند الانتهاء.
5. حدد نقطتي البداية والبذور عن طريق تعيين أكبر وأنحف قياسات القطر، والتي يمكن قياسها باستخدام وضع شريحة .
6. قم بتعيين نقطة بداية على حافة منطقة الاهتمام. لتحقيق الإضافة اليدوية أو إزالة نقاط البداية، قم أولا بتغيير وضع المؤشر ( التنقل | حدد ) ثم Shift + انقر بزر الماوس الأيمن في نقاط الاهتمام.
7. حدد العتبات اليدوية للنقاط الأولية للتأكد من وضع علامة على كل الأشجار المرئية. تغيير وضع المؤشر (التنقل | حدد ) ثم Shift + انقر بزر الماوس الأيسر في نقاط الاهتمام لإضافة أو إزالة النقاط الأولية يدويا.
   ملاحظة: من المهم إزالة ضوضاء الخلفية والإشارات يدويا من الأعصاب المجاورة.
8. حدد المربع قم بإزالة النقاط الأولية حول نقاط البداية.
9. تحقق من إزالة المقاطع غير المتصلة للسماح باستبعاد النقاط البعيدة جدا، والتي قد تمثل ضوضاء في الخلفية. حدد الحد الأقصى لطول الفجوة في الخطوة التالية لتحديد الحد الأعلى للاستبعاد.
10. اضبط عتبة طرح الخلفية ، والتي تستخدم مرشح Gaussian لتقدير شدة الخلفية لكل فوكسل.
11. قم بتعيين العتبة التلقائية لقطر التغصنات باستخدام خوارزمية مساحة المقطع العرضي التقريبية.
12. تخطي خطوات حساب العمود الفقري.
13. قم بإنهاء العملية واختر النمط واللون المطلوبين.
14. قم بإلغاء تحديد مربع المجلد في الخصائص لعرض المحاور المعاد بناؤها فقط.
15. ضمن علامة التبويب الإحصائيات ، حدد مفصل. استخدم رقم الفتيل. النقاط الطرفية للتغصنات لتحديد الأطراف العصبية الحركية كمؤشر على تشجير المحور العصبي الحركي.
    ملاحظة: يمكن إضافة تعليق توضيحي إحصائي إذا رغبت في ذلك.
16. تصدير صورة المحور العصبي المعاد إنشاؤه كملف .tif.

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root='1' data-sheets-baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Hb9::GFPThe Jackson labortory< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>005029Collect Embryos of the Embryonic Day 13.5 (E13.5)4٪ Paraformaldehyde (PFA) for 200ml: أضف 20 مل 10X PBS ، 8 جم PFA في ماء مقطر مزدوج. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (10N). قم بتعقيمها وتخزينها عند -20 درجة مئوية.Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) ل 1 لتر: أضف 80 جم كلوريد الصوديوم ، 2 جم KCl ، 14.4 جم فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم ، 2.4 جم فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم وقم بتغطيتها بالماء المقطر المزدوج. الأوتوكلاف وتخزينه في RT.Triton X-100SigmaX100-500ML < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;extding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Fetal Bovine SerumThermoFisher26140079 Sheep-polyclonal anti-GFPAbD Serotec< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>4745-10511:1000Alexa Fluor 488 donkey anti-sheepInvitrogen< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>A-110151:1000< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>RapiClear 1.47 clearing reagentSunJin LabRC147001 < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-left: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden; padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>1.5ml micro tube < td style ='border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden; padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>Sarstedt72.690.001 < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>24 Wells Plate< TD style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>ThermoFisher< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>142475 5 SA Tweezerideal-tek3480641 Iris Scissors striaght حاد / حادAesculapBC110R -micros-surgery compels, single useAesculap< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>BA365 dissecting microscopeNikon< td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>SMZ800 < td style='border-bottom:1px solid #000000;border-left:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>ShakerTKSRS-01< td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Lightsheet Z.1 microscopeCarl Zeiss Microscopy برنامج تحليل الصور Imaris 8.4.0 < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;'>Bitplane ، زيورخ ، سويسرا < td style = 'border-bottom: 1px solid # 000000 ؛ border-right: 1px solid # 000000 ؛ overflow: hidden ؛ extding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style='border-bottom: 1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice)The Jackson Laboratory005029