التصوير الكيميائي النسيجي للوحدات القشرية في أقسام الدماغ المسطحة

الملخص

Source: < نمط الامتداد = '-webkit-text-decoration-skip: none ؛ font-family: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص - تخطي الحبر: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ >Lauer ، S. M. ، et al. Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices. (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصور الوحدات القشرية في أقسام الدماغ المسطحة باستخدام التلوين الكيميائي النسيجي. يتم التعامل مع الأقسام الثابتة مسبقا بكاشف إجهاد يسلط الضوء على العناقيد العصبية النشطة ، ويشكل مناطق مظلمة عالية التباين. بعد التركيب والجفاف ، تظهر الوحدات القشرية تحت مجهر المجال الساطع كأنماط مظلمة غير مكتملة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المناسبة.

1. تصور الوحدات القشرية باستخدام تلطيخ أوكسيديز السيتوكروم

ملاحظة: تم تطوير بروتوكولات تلطيخ مختلفة للكشف الكيميائي النسيجي عن نشاط السيتوكروم أوكسيديز. يستخدم هذا البروتوكول كبريتات النيكل والأمونيوم (NiAS) ، مما ينتج عنه تباين أعلى ووحدات محددة بشكل أفضل في المناطق القشرية الملطخة.

1. تحضير محلول تلطيخ السيتوكروم أوكسيديز. للحصول على 10 مل من المحلول ، أضف 10 مل من 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) (0.1 م ، درجة الحموضة 7.4) ، 400 مجم سكروز ، 12.5 مجم NiAs ، 2 مجم سيتوكروم C ، و 6 مجم ديامينوبنزيدين (DAB).
   } تنبيه: DAB و NiAS مسببة للسرطان.
   } ملاحظة: أضف DAB قبل احتضان الأقسام مباشرة.
2. اغسل الأقسام في المخزن المؤقت HEPES (0.1 م ، درجة الحموضة 7.4) على شاكر لمدة 15 دقيقة.
3. احتضان الأقسام في محلول التلوين في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
   } ملاحظة: راقب سرعة التلوين. إذا لم يكن هناك رد فعل مرئي ، فقم بالتغيير إلى الحضانة عند 37 درجة مئوية. اعتمادا على مقدار التثبيت ، يمكن ملاحظة التلوين بعد 10 دقائق أو في عدة ساعات.
4. أوقف التفاعل بإضافة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) ؛ هذا يمنع إعادة الموت غير المرغوب فيه وزيادة إشارة الخلفية.
5. اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت HEPES لمدة 10 دقائق.
6. قم بتركيب وجفف الأقسام على الشرائح الزجاجية.
7. قم بتجفيف الأقسام بصف كحول متزايد:
   1. اغسل الشرائح في 60٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة. اغسل الشرائح في 80٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة. اغسل الشرائح في 96٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين. اغسل الشرائح بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق. اغسل الشرائح في الأيزوبروبانول لمدة 5 دقائق. اغسل الشرائح بالزيلين لمدة 5 دقائق.
8. أضف على الفور وسيطا سريع التركيب وأضف غطاء للاستخدام. حرج: لا تستخدم وسائط التركيب ذات الأساس المائي ، حيث سيتم غسل NiAS وتحلل من تلطيخها.
9. احتفظ بالأقسام عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأجل.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تلطيخ السيتوكروم أوكسيديز السيتوكروم ج من قلب الخيولSigma-AldrichC25063،3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride هيدراتSigma-AldrichD5637HEPESكارل روث9105.4 تركيب أو تجميد وسائط يوكيت (الكيمياء النسيجية) سيجما ألدريتش3989الجفاف الكحولي الإيثانول 100٪ كارل روث9065.3الإيثانول 96٪ كارل روثP075.32-بروبانولكارل روث6752.4بديل الزيلينفلوكا78475الأجهزة / الأدوات دومون 55 ملقط - أدوات العلوم الدقيقة إينوكس11255-20دومون 5 ملقط - طرف علم الأحياء إينوكسأدوات العلوم الدقيقة11252-30ملقط دومون 5SF - أدوات العلوم الدقيقة فائقة الدقة من إينوكس11252-00