تحليل الخلايا المناعية في الأنسجة العصبية للفأر باستخدام قياس التدفق الخلوي

الملخص

Hidmark، AS. ، et al. تحليل الخلايا المناعية في الأعصاب الوركي المفردة والعقدة الجذرية الظهرية من فأر واحد باستخدام قياس التدفق الخلوي. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل الخلايا المناعية في الأعصاب الوركي للفأر والعقد الجذرية الظهرية (DRGs). تتضمن العملية تسمية الخلايا المناعية بالأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور والبيوتين ، وتثبيت الخلايا ونفاذها ، واستخدام علامات الفلورسنت للكشف عن سطح الخلية والخصائص النووية. تتيح هذه التقنية تقييما كميا لعدم تجانس الخلايا المناعية في الأنسجة العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات المناسبة.

1. هضم العصب الوركي و DRG

1. تحضير وسط الهضم (وسط النسر المعدل من دولبيكو [DMEM] ، 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض [HEPES] ، 5 مجم / مل ألبومين مصل الأبقار [BSA] ، 1.6 مجم / مل كولاجيناز من النوع 4) مكملا ب 100 ميكروغرام / مل من ديوكسيربونوكلياز ، وتخزينها على الثلج.
   ملاحظة: كمية وسط الهضم المطلوبة لكل فأر (الأعصاب الوركي + DRGs) هي 1 مل. بمجرد التحضير ، يمكن تخزين حصص من وسائط الهضم عند -20 درجة مئوية.
2. نقل الأعصاب الوركي و DRGs من فأر واحد إلى أنابيب منفصلة سعة 1.5 مل تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائط الهضم. بالنسبة للأعصاب الوركي ، قم بتقطيع المادة إلى 15-20 قطعة باستخدام مقص زنبركي ثم احتضان معلقات الأنسجة في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع تحريك لطيف (≤ 450 دورة في الدقيقة).
3. قم بترتيبات معلق الخلية بشكل متكرر من خلال طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لفصل أي أنسجة غير مهضومة بشكل كامل.
   ملاحظة: إذا كان من الصعب معايرة التعليق ، فقم بقص طرف الماصة بالمقص لإنشاء نهاية غير حادة. احتضان تعليق الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع تحريك لطيف (≤ 450 دورة في الدقيقة).
4. كرر عملية التخلي من خلال طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر واحتضانه لمدة 10 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف (≤ 450 دورة في الدقيقة).
5. تحضير عازلة FACS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS] مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ [FCS] و 1 ملي مولار حمض رباعي الأسيتيك إيثيلين ديامين [EDTA]) وتخزينها على الثلج. اشطف وانقع حاجزا من الفولاذ المقاوم للصدأ بحجم شبكي يبلغ 140 ميكرومتر مع عازلة لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) في طبق بتري مقاس 60 × 15 مم على الثلج.
   ملاحظة: يجب تجنب مرشحات شاشة النايلون لأنها تؤدي إلى خسارة كبيرة في إنتاجية الخلايا النواة.
6. قم بتمرير تعليق الأنسجة بشكل متكرر من خلال مرشح الشاشة 140 ميكرومتر ، حيث يتم تثبيته فوق طبق بتري ، باستخدام ملقط حاد ، على الجليد. اجمع معلق الخلية من طبق بتري وانقله إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل مخزن على الجليد.
7. ادفع أي أنسجة غير مهضومة بالكامل متبقية على الفلتر عن طريق التجربة المتكررة بطرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر. اشطف مرشح الشاشة مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS واجمع تعليق الخلية الناتج في طبق بتري ليتحد مع تعليق الخلية من الخطوة 1.6.
   ملاحظة: إذا كان مقياس التدفق الخلوي المستخدم حساسا للحطام ، فيمكن تمرير تعليق الخلية من الخطوة 1.7 عبر مرشح شاشة 70 ميكرومتر. ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى فقدان محصول الخلايا النواة.
8. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. كرر خطوة الغسيل هذه مرة واحدة.
9. أعد تعليق حبيبات الخلية في 150-350 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، اعتمادا على عدد التلوين المطلوب (150 ميكرولتر عازلة FACS لكل لوحة تلطيخ).

2. تلطيخ العصب الوركي و DRG بالأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت لقياس التدفق الخلوي

1. نقل 100 ميكرولتر من العصب الوركي أو تعليق خلية DRG إلى بئر على شكل حرف V في صفيحة 96 بئرا على الجليد.
   ملاحظة: تعتبر الخلايا أحادية اللون ضرورية لجميع الأجسام المضادة المستخدمة لأنها ستوفر الضوابط اللازمة لإعداد قياس التدفق الخلوي فيما يتعلق بمكاسب جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) والتعويض ، وكذلك للمساعدة في التمييز بين الارتباط المحدد وغير المحدد.
2. قم بتجميع معلقات الخلايا المتبقية (حوالي 50 ميكرولتر لكل عينة) إما من الأعصاب الوركي أو عينات DRG ، لتكون بمثابة عنصر تحكم غير ملوث.
3. قم بالطرد المركزي للوحة على حرارة 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة فوق سلة المهملات ووضع نقرة حادة من المعصم ، واضغط برفق على المناشف الورقية حتى تجفف.
4. بالنسبة لتلوين السطح ، أعد تعليق كل حبيبات من كريات الخلية في 20 ميكرولتر من محلول FACS الذي يحتوي على الأجسام المضادة ذات الأهمية (CD45-A647 ، CD11b-PerCP / Cy5.5 ، ومركب التوافق النسيجي الرئيسي [MHC] الفئة الثانية - البيوتين) واحتضانه ، محميا من الضوء ، على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   } ملاحظة: (1) يجب تحديد التخفيف الأمثل للأجسام المضادة قبل الاستخدام عن طريق إجراء التخفيف سلسلة وفقا لمعلومات المنتج الخاصة بالشركة المصنعة ؛ (2) يمكن تقليل التلوين غير المحدد عن طريق الحضانة باستخدام كتلة FC في هذه الخطوة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ؛ و (3) لا يلزم تلطيخ التحكم في النمط المتماثل بشكل عام عند استخدام الأجسام المضادة الأولية المقترنة مباشرة بالفلوروفور و / أو عندما ينتج المستضد (المستضدات) ذات الأهمية مجموعات متميزة.
5. أضف 130 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر وقم بالطرد المركزي للوحة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.3) واغسل كريات الخلية مرتين باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
   ملاحظة: في حالة استخدام جسم مضاد أولي غير مترافق أو جسم مضاد أولي مقترن بالبيوتين ، فيمكن إضافة كاشف ثانوي مناسب ، مترافق مع فلوروفور ، في هذه المرحلة وتتكرر الخطوات 2.4-2.5. في حالة هذا البروتوكول ، تم استخدام Streptavidin-PE / Cy7 أو Streptavidin-PerCP للكشف عن معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية بالاشتراك مع CD45-A647 / CD11b-PerCP / Cy5.5 ، أو بالاشتراك مع CD68-APC و F4 / 80-PE / Cy7 ، على التوالي.
6. للتثبيت ، بعد خطوة الغسيل الأخيرة ، أعد تعليق كريات الخلية في 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4). احتضان اللوحة على الجليد لمدة 10 دقائق ثم جهاز الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.3) واغسل كريات الخلية مرة واحدة باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
   تحذير: بارافورمالدهيد سام. ارتد الحماية المناسبة مثل القفازات والنظارات ، إلخ .
   ملاحظة: أعد تعليق كريات الخلية في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بتخزينها محمية من الضوء، عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يومين. إذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ داخل الخلايا ، فانتقل إلى الخطوة 2.11 بعد الطرد المركزي للوحة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. للتلوين داخل الخلايا ، أعد تعليق كريات الخلية في 150 ميكرولتر من FACS المؤقت + 0.5٪ منظف ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة ، محمي من الضوء لمدة 15 دقيقة. قم بالطرد المركزي للوحة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.3) واغسل حبيبات الخلية مرة واحدة باستخدام 150 ميكرولتر من محلول FACS + 0.5٪ منظف. أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS + 0.5٪ منظف يحتوي على الأجسام المضادة ذات الأهمية (CD68-APC ، CD206-PE) واحتضانها ، محميا من الضوء ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
8. أضف 130 ميكرولتر من محلول FACS + 0.5٪ منظف لكل بئر وقم بالطرد المركزي للوحة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية كما كان سابقا موصوفة (الخطوة 2.3) وغسل كريات الخلية مرتين باستخدام 150 ميكرولتر من محلول FACS + 0.5٪ منظف.
   ملاحظة: في حالة استخدام جسم مضاد أولي غير مترافق أو جسم مضاد أولي مترافق مع البيوتين ، فيمكن إضافة كاشف ثانوي مناسب ، مترافق مع فلوروفور ، في هذه المرحلة وتكرار الخطوات 2.9-2.10.
9. أعد تعليق كريات الخلية في 150 ميكرولتر من محلول FACS + 0.5٪ منظف وخزنها ، محمية من الضوء ، على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يومين.
10. أعد تعليق كريات الخلية بمحلول FACS سعة 150 ميكرولتر + 0.5٪ منظف مكمل ب 5 ميكروغرام / مل 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. قم بالطرد المركزي للوحة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.3).
11. أعد تعليق كريات الخلية في 150 ميكرولتر من PBS ونقلها إلى أنبوب FACs مسمى بشكل مناسب. يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، محميا من الضوء ، حتى يصبح جاهزا للتحليل.
    ملاحظة: بعد إعادة التعليق في PBS ، يجب تحليل الخلايا في غضون ساعات ، لأن DAPI سوف ينفصل ببطء عن الحمض النووي ، مما يؤدي إلى فقدان الإشارة.

3. إعداد قياس التدفق الخلوي وتشغيل العينات

1. تأكد من أن مقياس التدفق الخلوي مجهز بالليزر و / أو مجموعات المرشحات المناسبة لقياس الفلوروفورات المستخدمة في تلطيخ الخلايا. يمكن تحديد ذلك ضمن التكوين الافتراضي لمقياس الخلايا على النظام. في حالة هذا البروتوكول ، تم تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي المجهز بثلاثة ليزر (405 نانومتر و 488 نانومتر و 633 نانومتر) مما يسمح باكتشاف ≤ 5 فلوروفورات.
2. حدد القنوات المناسبة للكشف عن الفلوروفورات ذات الأهمية. من الأفضل اكتشاف جميع إشارات الفلورسنت من خلال التضخيم اللوغاريتمي.
3. حدد معدل تدفق مناسب للعينات. يمكن أن تختلف هذه المعلمة اعتمادا على النظام المستخدم ويجب تحديدها تجريبيا. في حالة هذا البروتوكول ، تم استخدام معدل تدفق MED-to-HI (35-60 ميكرولتر / دقيقة) لمنع انسداد الإبرة.
4. حدد العدد الإجمالي للأحداث/الخلايا التي سيتم جمعها لكل عينة. يجب أن يكون الحد الأدنى لعدد الأحداث 1,000,000.
5. قم بإنشاء مخططات مبعثرة ضمن ورقة عمل عالمية لمنطقة التشتت الجانبية (SSC-A) مقابل منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ، وكذلك لكل فلوروفور ذي أهمية مقابل FCS-A. قم بإنشاء طريقة عرض إحصائية تعرض عدد الأحداث ومتوسط شدة الفلورسنت (MFI) للفلوروفورات المحددة.
6. اضبط جهد قنوات FSC-A و SSC-A ، بحيث تتناسب أصغر الخلايا مع الجزء السفلي الأيسر بنسبة 10٪ من مخطط التشتت. حدد مضان الخلفية والحد الأدنى من مضان العينة من عناصر التحكم غير الملوثة من الأعصاب الوركي أو DRGs. حدد البوابة الأصلية (P1) بناء على مخطط التشتت من عناصر التحكم في التلوين DAPI فقط.
   ملاحظة: هذه ليست بوابة تجميع ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الطبيعة غير المتجانسة لمجموعة DAPI + في الجهاز العصبي المحيطي (PNS).
7. باستخدام مخططات مبعثر FSC لكل من الفلوروفورات ذات الأهمية ، اضبط الفولتية بحيث تقع خلايا التحكم غير الملوثة ضمن الربع السفلي من مخططات التشتت الخاصة بها. ثم يتم إنشاء البوابات فوق هذه المنطقة لتحديد تلك الخلايا الإيجابية لكل علامة من العلامات / الفلوروفورات المعنية. يتم تأكيد وضع البوابة عن طريق تشغيل عنصر التحكم أحادي اللون (الخطوة 2.1).
   ملاحظة: يمكن إجراء التعويض عن أطياف البث المتداخلة في هذه المرحلة أو تطبيقه بأثر رجعي باستخدام برنامج التحليل المناسب.
8. بمجرد إعداد مقياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح ، يمكن تشغيل العينات.
9. بعد التشغيل، يمكن تجاهل عينة المواد المتبقية، ويمكن تصدير ملفات FCS لمزيد من التحليل.

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-resize' style = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets root='1' data-sheets-baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style='color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>C57BL / 6 MouseCharles RiverC57BL / 6NCrl < td style = 'اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>DMEM (+ 1 جم / لتر جلوكوز ، جلوتامين ، بيروفات) < td style = 'اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Thermo < td style = 'اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>31885023< td style='اللون:#1a202c;حجم الخط:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> مصدر هذه المادة ليس مهماHEPESSigma-AldrichH3375 ألبومين مصل البقر (BSA)Sigma-AldrichA2153 Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corp., USLS004188 < td style = 'color: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ overflow: hidden ؛ boardding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>Deoxyribonuclease (DNase) I من البنكرياس البقري I Sigma-Aldrich < td style = 'اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>DN25-1g < td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛> Ethylenediaaminetetraacetic acid acid (EDTA)Sigma-AldrichE6758< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> مصل العجل الجنيني (FCS), الحرارة غير معطلةSigma-AldrichF4135body المضاد ضد CD11b-PerCP/Cy5.5Biolegend101228< td style='color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>clone M1/70body المضاد ضد معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية، biotinylatedBiolegend107603Clone M5/114.15.2body antibody against CD45-A647Biolegend107603clone 30-F11Streptavidin-PE/Cy7Biolegend405206< td style = 'اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>Streptavidin-PerCPBiolegend < td style = 'اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>405213< td style = 'color: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ overflow: hidden ؛ boardding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> يستخدم للكشف عن MHCII-biotin مع CD68-APC و F4 / 80-PE / Cy7Triton-X 100Sigma-AldrichT8787 DAPISigma-AldrichD9542-1MG تمييع في PBS إلى 50x و يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام غربال تفكك الخلية - طقم طاحونة الأنسجة< نمط td = 'اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Sigma-Aldrich < td style = 'اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>CD1V-shaped ، 96-well platesGreiner / SigmaM8185< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mmBD Biosciences352008< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> 60x15mm petri dishGreiner / SigmaZ643084 < td style = 'color: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> bd lsr ii Flow Cytometer < td style = 'color: #1a202c ؛ حجم الخط: 12pt ؛ overflow: hidden ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '>BD Biosciences < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>