الاستئصال الانتقائي بالليزر أحادي الخلايا العصبية في يرقة الزرد باستخدام مجهر متحد البؤر

الملخص

Source: Morsch, M., وآخرون. ، Trigger cell stress and death using conventional uv laser confocal المجهري. J. Vis. Exp. (2017)

البروتوكول

1. Prepare Solutions لتضمين سمك الزرد في agarose.
   1. قم بإعداد محلول تخدير عن طريق إضافة 4 جم / لتر MS222 (محلول مخزون ثلاثي الكنائين، درجة الحموضة 7.0) بالتنقيط إلى طبق بتري يحتوي على ماء البيض. جرعة 50 مجم / لتر هي نقطة انطلاق موصى بها (< span style = 'font-family: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ محاذاة رأسية: خط الأساس ؛ المسافة البيضاء: التفاف مسبق ؛ '>الشكل 1Aالشكل 1B). style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>NOTE:
   2. للقيام بذلك، ضع ~ 300 ميكرولتر من الاغاروز على طول الدائرة الداخلية للطبق ذو القاع الزجاجي لتحضير دائرة على شكل دونات مع فتحة صغيرة في المنتصف لوضع السمكة (الخطوة 1.5.3).

style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;عائلة الخط:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>

select 1-3 من الأسماك التي تم فحصها مسبقا للاستئصال وتخدير اليرقات عن طريق نقلها (باستخدام ماصة نقل) إلى طبق بمحلول التخدير (الخطوة 1.4.1; الشكل 1C; approximately 5 min).
NOTE: الشكل 1D). style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>الشكل 1E). إذا كنت تعمل مع أسماك متعددة ، فقم بمحاذاة جميع الأسماك في الطبق بحيث يمكن تحديد موقعها بسهولة باستخدام المجهر متحد البؤر لاحقا.
NOTE:الشكل 1F).

2. قم بإعداد المجهر متحد البؤر ومعلمات التصوير

1. ضع طبق بتري مع اليرقة المضمنة على مرحلة المجهر متحد البؤر وركز على الجانب الظهري للحبل الشوكي الحيواني (باستخدام مجال ساطع). افحص تحت التكبير المناسب (40X) وإعداد الفلورسنت وتصور هيكل الاهتمام (e.e.,الشكل 2). نستخدم بشكل روتيني هدف 40X لإجراء دراسات الفاصل الزمني الخاصة بنا.
2. على سبيل المثال، microglial movement to established baseline speed and moveability).
4. باستخدام z-drive، تحقق من الجزء العلوي والسفلي من الهيكل محل الاهتمام (e.e., the cell soma) عن طريق التركيز يدويا لأعلى ولأسفل. قم بتدوين المستوى z الذي سيتم استئصاله (e.e., the center of cell).
   NOTE:e.e., الشكل 43. إجراء استئصال الليزر المستهدف للخلايا الفردية في الزرد الحبل الشوكي
   < نمط p = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ ارتفاع الخط: 1.3800000000000000001 ؛ هامش أسفل : 12pt ؛ هامش أعلى : 0pt ؛ dir = 'ltr' >for this eloation and visualization, was used a confocal microscope (Leica SP5). تم تفصيل إجراء الاستئصال باستخدام الصمام الثنائي 405 نانومتر للتدمير الخاص بالخلية وفقا للبرنامج (Leica Application Suite ، v2.7.3.9723). ومع ذلك ، فإن أي مجهر متحد البؤر التقليدي المجهز بليزر 405 نانومتر و FRAP (استعادة التألق بعد التبييض الضوئي) أو وحدة التبييض سيسمح بأداء نفس التلاعب الخلوي ، ولكن من المحتمل أن يكون ذلك بإعدادات ومعلمات وأسماء مختلفة قليلا.
   1. ابدأ معالج FRAP بالنقر فوق القائمة المنسدلة في الجزء العلوي من قائمة البرامج (الشكل 3A, 1 and 2). راقب نافذة جديدة بخطوات مختلفة تسمح بإعداد المعلمات المحددة للاستئصال بالليزر (الشكل 3B, 3).
   2. الشكل 3 ب, 4) and average (الشكل 3B, 5). كان تنسيق الصورة 1,024 × 1,024 بسرعة مسح 400 هرتز ومتوسط الخط 4 هو الأكثر قابلية للتطبيق.
      NOTE:
   3. if لم يتم تحديد المستوى z للاستئصال بالفعل (كما هو موضح في الخطوة 2.4.)، فاضغط على الزر "Live" وركز من خلال العينة حتى يتم التركيز على الهيكل الفلوري أو المستوى z المطلوب الذي سيتم استئصاله في بؤرة التركيز.
   style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;عائلة الخط:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>الشكل 3C6) للتحكم في مكونات الاستئصال المحددة.
   NOTE: A مزيج من شدة الليزر (الشكل 3C، 8) وسرعة المسح، والمتوسط الذي تم تعيينه في الخطوة 3.2 (الشكل 3B, 4 and 5)، بالإضافة إلى عدد التكرارات التي سيتم تعيينها في الخطوة 3.5 (الشكل 3E, 12) ، سيحدد وقت السكون الكلي لليزر فوق البنفسجي عند عائد الاستثمار ، وبالتالي كفاءة التبييض.
   1. قم بإشراك الليزر 405 نانومتر عن طريق تنشيطه لإجراء التبييض (الشكل 3C, 8).
      NOTE: الشكل 3C, 7الشكل 3D, 10) للاستئصال باستخدام أي من أدوات الرسم في نافذة الحصول على الصورة (الشكل 3D, 9). استهدف التل المحوري ، على سبيل المثال ، باستخدام أداة الرسم الدائري التي تبلغ حوالي 4-8 ميكرومتر.
      NOTE:الشكل 3E11) وتأكيد عدد الدورات التي سيتم مسح / استبعاد عائد الاستثمار (الشكل 3E, 12الشكل 3E, 13) ومراقبة كفاءة الاستئصال.
      NOTE: على سبيل المثال ، الشكل 3C، 8), scan can and average (الشكل 3B, 4 and 5) and repetitions (الشكل 3E, 12) في حالة استمرار ظهور عائد الاستثمار المحدد لإظهار كثافة مضان عالية بعد الانتهاء من FRAP دور.

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets-root = '1' data-sheets-baot = '1'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Agarose low meltingFisher-Scientific يذوب في ماء البيض مع التريكيين (0.02٪) عند 0.8-1.5٪< td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-size:10pt;overflow:hidden;boardding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>TricaineArgent Labs< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>MS-222 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>0.02٪ < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة كسر ؛ التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ '> البورسليكات القياسية لجدار هارفارد مع خيوط زجاج شعري < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> العالمية للأدوات الدقيقة ، Inc.< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>GC100F-10 (قصير)
GC100F-15 (طويل) < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10pt ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> السحب إلى مقاومة 2 -7 MΩ< td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;حجم الخط:10pt;overflow:مخفي;الحشوة:0px 3px;vertical-align:bottom;a-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Egg water heat blockselect BioProducts< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10pt ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> سخان الكتلة الرقمية (SBD110_) < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10pt ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ > المجهر < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10 نقاط ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> Leica < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ حجم الخط: 10 نقاط ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>SP5< td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> 35mm الزجاج أسفل الطبقMatTek Corporation< td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;حجم الخط:10pt;overflow:مخفي;الحشوة:0px 3px;vertical-align:bottom;a-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>P35G-0-20-C