المراقبة المورفولوجية والفسيولوجية لكرويات الورم باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري

الملخص

المصدر: هوانغ، واي. وآخرون. al., المراقبة المورفولوجية والفسيولوجية الطولية لكرويات الورم ثلاثية الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري. J. Vis. Exp.. (2019)

}{{}}{{}}{{}}{{}}{{}}} يوضح هذا الفيديو استخدام التماسك البصري التصوير المقطعي (OCT) لمراقبة كرويات الورم في صفيحة متعددة الآبار عن طريق التقاط صور مقطعية عالية الدقة. من خلال تحليل انعكاسات الضوء من الهياكل الخلوية ، يقوم OCT ببناء نماذج ثلاثية الأبعاد لتقييم السمات المورفولوجية مثل الحجم والشكل مع التمييز أيضا بين الخلايا القابلة للحياة والخلايا غير القابلة للحياة بناء على تغيرات تشتت الضوء بمرور الوقت.

البروتوكول

1. تحضير الخلايا

1. الحصول على خطوط الخلايا من مورد مؤهل.
   ملاحظة: تحقق من أن الخلايا من خطوط الخلايا ذات الأهمية يمكن أن تشكل كرويات في وسط الثقافة أو بمساعدة الركيزة (مصفوفة الغشاء القاعدي مثل Matrigel). انظر إلى الأدبيات أو قم بإجراء جولة واحدة من التجربة المسبقة للتحقق.
2. قم بإذابة الخلايا المجمدة باتباع الإجراء المحدد الذي يوفره مورد خط الخلية. يمكن العثور على إجراء عام في مكان آخر.
3. استزراع الخلايا ل 1-2 مقاطع في قوارير ثقافة 25 سم ² قوارير ثقافة. ثم تكون الخلايا جاهزة للاستخدام في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.
4. راقب الحالة الصحية للخلايا يوميا واحتفظ بها في حاضنة في ظل الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO ₂ ، 95٪ رطوبة). قم بتحديث الوسائط حسب الحاجة.
   ملاحظة: يتكون وسط الاستزراع من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco (4.5 جم / لتر جلوكوز) ، و 1٪ مضاد حيوي ومضاد للفطريات ، و 10٪ مصل بقري جنين (FBS). خلايا الزراعة الفرعية قبل أن تصل إلى التقاء في قارورة الاستزراع. اتبع إرشادات زراعة الخلايا المقدمة من المورد. يمكن العثور على إجراء عام في مكان آخر.
5. قم بإجراء زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد في ألواح متعددة الآبار بناء على البروتوكول العام التالي.
   1. قم بإزالة وسائط الاستزراع من قارورة الاستزراع واغسلها بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ، مسخن إلى 37 درجة مئوية).
   2. أعد تعليق الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من حمض التربسين إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA ، 0.5٪) في القارورة لمدة 3 دقائق. ثم أضف وسائط الثقافة لتخفيف التربسين.
   3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × g ودرجة حرارة الغرفة.
   4. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا باستخدام 4 مل من وسط الثقافة الدافئ مسبقا. ماصة قطرة واحدة من العينة على مقياس كثافة الدم لعد الخلايا لتحديد تركيز الخلية. خفف الخلايا إلى التركيز المناسب للبذر ( على سبيل المثال ، 3,000 خلية / مل).
      ملاحظة: قم بتحسين التركيز الأولي للخلية الكروية لكل خط خلية وكل نوع من الألواح متعددة الآبار (96 بئر أو 384 بئر أو 1536 بئر).
   5. ضع خلايا البذور في صفيحة متعددة الآبار ذات قاع دائري منخفض للغاية (ULA). أضف 200 ميكرولتر من معلق الخلية في كل بئر بتركيز 3000 خلية / مل بحيث يحتوي كل بئر على حوالي 600 خلية.
   6. في درجة حرارة الغرفة (RT) ، قم بالطرد المركزي للوحة بأكملها باستخدام محول لوحة لمدة 7 دقائق ، مباشرة بعد البذر ، بسرعة 350 × g أو أقل سرعة متاحة.
      ملاحظة: يساعد جهاز الطرد المركزي على تجميع الخلايا إلى وسط البئر لتسهيل تكوين كروي واحد موحد. يتم تنفيذ خطوة الطرد المركزي مرة واحدة فقط في البداية لتشكيل كرويات الورم. لن يتكرر عندما تبدأ كرويات الورم في النمو.
   7. حافظ على اللوحة متعددة الآبار عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ₂ في حاضنة الثقافة وتحديث وسائط الاستزراع كل 3 أيام.
      ملاحظة: قد يختلف وقت النمو باختلاف ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد. في دراستنا ، تم استخدام 3000 خلية / مل لكل من خطوط الخلايا U-87 MG و HCT 116 في ألواح 96 بئرا ، بحيث يمكن أن ينمو الكروي إلى ~ 500 ميكرومتر في 4-20127 يوما لخلايا HCT 116. استنادا إلى بروتوكول الثقافة ثلاثي الأبعاد العام ، ضع في اعتبارك إضافة مكملات الوسائط وعوامل النمو لنماذج كروية مختلفة.
   8. إجراء التصوير المقطعي البصري (OCT) للورم الكروي كل 3-20124 يوما لإجراء دراسة طولية لنموها.
      ملاحظة: النقاط الزمنية الموصى بها لتصوير OCT هي اليوم 4 واليوم 7 واليوم 11 واليوم 14 واليوم 18 واليوم 21.

2. منصة تصوير OCT عالية الإنتاجية

ملاحظة: انظر الشكل 1 للحصول على تفاصيل عن نظام التصوير OCT المخصص المستخدم في هذه الدراسة.

1. اختر مصدر ضوء عريض النطاق مناسبا لنظام OCT للتصوير الكروي للورم.
   ملاحظة: هنا ، تم استخدام الصمام الثنائي الفائق (SLD ، الشكل 1 أ ، B ) بطول موجي مركزي ~ 1,320 نانومتر وعرض نطاق ترددي 110 نانومتر كمصدر للضوء عريض النطاق.
2. قم ببناء الذراع المرجعي وذراع العينة لنظام OCT باتباع المخططات (انظر الشكل 1A, {B للحصول على التفاصيل). يسرد { المواد المكونات البصرية اللازمة لبناء نظام OCT. تأكد من تطابق أطوال المسار البصري للذراع المرجعي وذراع العينة بشكل وثيق.
3. قم ببناء مقياس الطيف ، بما في ذلك الموازاة ، والشبكة ، وعدسة F-theta ، وكاميرا مسح الخط (انظر الشكل 1C للإعداد) للحصول على تفاصيل حول تصميم مطياف OCT. بدلا من ذلك ، حدد مطياف تجاري يطابق الطول الموجي المركزي لمصدر الضوء. تأكد من محاذاة مقياس الطيف بشكل صحيح لتغطية عرض النطاق الترددي لليزر بالكامل ، لتحقيق كفاءة عالية في جمع الفوتون ، ولتوفير غسل بطيء لنمط التداخل.
4. قم بتمييز أداء نظام OCT ، بما في ذلك المقاييس التالية مثل قوة ذراع العينة ، وعمق التصوير الكلي ، والحساسية المعتمدة على العمق ، والدقة المحورية ، وعمق التركيز ، والدقة الجانبية. ضع عاكس ضعيف ( على سبيل المثال ، مرآة بمرشح كثافة محايد) كعينة لقياس الحساسية المعتمدة على العمق والدقة المحورية وعمق التركيز البؤري. ضع هدف مخطط اختبار دقة القوات الجوية الأمريكية (USAF) كعينة للتحقق من الدقة الجانبية.
5. حدد مرحلة الترجمة الآلية لتوفير حركة أفقية للوحة متعددة الآبار لتصوير كرويات الورم في آبار مختلفة (انظر الشكل 1 ب ). استخدم مرحلة ذات نطاق سفر أكبر من 108 مم × 72 مم لضمان مسح كامل لجميع آبار اللوحة متعددة الآبار. استخدم مرحلة ترجمة آلية ثنائية الأبعاد (2D) أو ثلاثية الأبعاد (3D) مع التحكم في البرنامج لتمكين الموقع الدقيق لكل بئر وأتمتة نظام OCT للتصوير عالي الإنتاجية.
6. استخدم محول لوحة أو صمم حامل لوحة (عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد) لتثبيت اللوحة متعددة الآبار في وضع ثابت.
7. قبل إجراء أي تصوير OCT ، قم بتصحيح إمالة وتدوير اللوحة متعددة الآبار باستخدام مرحلة إمالة ثنائية الأبعاد ومرحلة دوران مثبتة على مرحلة الترجمة (انظر الشكل 1D ) لتقليل تباين مستوى التركيز من الآبار المختلفة. استخدم D2 و D11 و B6 و D6 و G6 كآبار إرشادية عند مراقبة مواقعها النسبية في صور OCT ( الشكل 1A).
8. اضبط دوران اللوحة للتأكد من أن الحواف متوازية مع اتجاه حركة المسرح بحيث تظل الآبار في نفس المواضع الأفقية في صور OCT ( الشكل 1E ). اضبط إمالة اللوحة لتكون موازية للطاولة البصرية بحيث تظل الآبار في نفس المواقع الرأسية لتصوير OCT ( الشكل 1F).
   ملاحظة: يساعد ضبط زاوية الإمالة والتركيز على تحسين جودة صورة OCT لجميع الآبار. ومع ذلك ، فإن الاختلافات في ارتفاع وسائط الاستزراع في الآبار المختلفة قد تسبب تغيرات في المسار البصري ، مما قد يؤدي إلى إلغاء تركيز الصورة الكروية. يمكن تنفيذ التركيز التلقائي للتحكم في المستوى البؤري لتصوير OCT لتحقيق جودة صورة محسنة. لا تحل خطوة الضبط جودة صورة OCT السيئة لكروي الورم بسبب المشكلات التالية: انحطاط الكروي بسبب موقع البذر الأولي. الارتفاع الكروي عند تضمينه في مصفوفات خارج الخلية المصنوعة بيولوجيا ؛ جودة لوحة رديئة مع اختلافات كبيرة في ارتفاع قيعان الآبار. يمكن تنفيذ تحكم إضافي في البرامج مع وظائف التركيز التلقائي أو المحاذاة الذاتية لتحسين أداء نظام التصوير OCT.
9. لجمع البيانات من كل بئر بالتتابع ، يتحكم برنامج كمبيوتر مخصص في الحصول على صورة OCT وحركة المرحلة.

3. مسح OCT ومعالجة كرويات الورم

1. في يوم تصوير OCT لكرويات الورم ، قم بإزالة اللوحة متعددة الآبار من الحاضنة. انقله تحت نظام التصوير OCT وضعه أعلى محول اللوحة.
   ملاحظة: يمكن إجراء تصوير OCT لكرويات الورم مع تشغيل غطاء لوحة البوليسترين أو إيقاف تشغيله. ومع ذلك ، فإن تكثيفات المياه على الغطاء بسبب التبخر من الآبار قد تؤثر على انتقال الضوء وتشوه مسار الضوء ، مما ينتج عنه صور OCT أقل مثالية من الكرويات.
2. اضبط ارتفاع اللوحة عن طريق التحرك على طول الاتجاه z لمرحلة الترجمة. حافظ على موضع المستوى البؤري عند ~ 100-200 ميكرومتر تحت السطح العلوي لكل كروي ، لتقليل تأثير المظهر البؤري غير المنتظم للعمق.
3. في البرنامج المخصص ، قم بتعيين نطاق فحص OCT مناسب ( على سبيل المثال ، 1 مم × 1 مم) لتغطية كروي الورم بالكامل وفقا لمراحل تطوره. انقر فوق حفظ المعلمات لحفظ الإعداد.
4. استخدم البرنامج المخصص للحصول على صور ثلاثية الأبعاد OCT لكرويات الورم واحدة تلو الأخرى لجميع آبار اللوحة التي تحتوي على كرويات. انقر فوق الزر معاينة لعرض صورة المعاينة وانقر فوق الزر Acquire للحصول على صورة OCT.
   ملاحظة: تأكد من جمع بيانات OCT الكروية عندما لا تكون المرحلة في حالة حركة. عادة ما يقع الكروي في وسط البئر السفلي على شكل حرف U. ومع ذلك ، قد يتم إزاحة الكرة الكروية في وسائط الثقافة عندما تتسارع المرحلة أو تتباطأ بسبب القصور الذاتي للكروي في وسائط الثقافة.
5. قم بمعالجة مجموعات بيانات 3D OCT لكرويات الورم لإنشاء صور هيكلية OCT باستخدام كود معالجة C ++ مخصص. انظر الشكل 2A للحصول على مخطط انسيابي للمعالجة اللاحقة لبيانات OCT.
   ملاحظة: انظر الشكل 3A للصور الهيكلية ثلاثية الأبعاد OCT التي تم إنشاؤها.
   1. معايرة حجم البكسل في جميع الأبعاد الثلاثة. أعد قياس الصور الهيكلية OCT على المقاييس المصححة.
      ملاحظة: تقيس المسافة في الاتجاه المحوري (الاتجاه z) لصور OCT فرق المسار البصري بين الذراع المرجعي وذراع العينة. وبالتالي ، يجب أن يؤخذ معامل الانكسار للعينة (n) في الاعتبار عند معايرة حجم البكسل في الاتجاه المحوري لإعادة التحجيم. في دراستنا ، نستخدم n = 1.37 كمعامل انكسار للورم الكروي.
6. قم بإنشاء صورة مجمعة من الصور الكروية باستخدام صور OCT ثنائية الأبعاد في ثلاث طائرات مقطعية XY و XZ و YZ عبر النقطة الوسطى للكروية. انظر الشكل 4C-E للحصول على الإخراج التمثيلي لصور الصور الكروية. قم بإجراء تسجيل صورة لجميع الكرويات ، باستخدام دالة MATLAB dftregistration ، للتأكد من أن النقاط الوسطى لجميع المركبات الكروية موجودة في نفس الموقع تقريبا.
7. احصل على عرض ثلاثي الأبعاد للكروی باستخدام برنامج تجاري أو مخصص.
   ملاحظة: توضح الخطوات التالية كيفية الحصول على عرض ثلاثي الأبعاد لكرويات الورم باستخدام البرامج التجارية.
   1. قم بتحميل بيانات 3D OCT في البرنامج.
   2. انقر فوق لوحة تجاوز . ثم انقر فوق إضافة مجلد جديد. اختر وضع Blend لاستخدامه في العرض ثلاثي الأبعاد.
   3. اضبط زاوية العرض عن طريق سحب الصورة باستخدام مؤشر الماوس.

4. القياس المورفولوجي لكرويات الورم ثلاثية الأبعاد

} ملاحظة: يعالج الرمز المكتوب حسب الطلب في MATLAB هذا القياس الكمي. انقر فوق الزر Run لبدء العملية. انظر الشكل 2 ب للحصول على المخطط الانسيابي لخطوات القياس الكمي المورفولوجي للكرويات.

1. تحديد القطر الكروي والارتفاع والحجم القائم على القطر.
   1. حدد صور OCT ثنائية الأبعاد في ثلاث طائرات مقطعية XY و XZ و YZ تعبر النقطة الوسطى للكروية.
   2. قم بقياس قطر وارتفاع الكروي في المستويين XY و XZ ، على التوالي.
   3. احسب الحجم الكروي المستند إلى القطر باستخدام:

، مع افتراض الشكل الكروي للورم.

2. تحديد حجم كروي قائم على الفوكسل.
   1. قم بتطبيق مرشح متوسط ثلاثي الأبعاد على البيانات الهيكلية OCT للكروی لإزالة البقع.
   2. قم بتقسيم كرويات الورم باستخدام مرشح الكشف عن حافة Canny ، إطارا تلو الآخر ، مع عتبة مناسبة تفصل المنطقة الكروية للورم عن قاع البئر.
   3. تجميع voxels الضام للبيانات ثلاثية الأبعاد (انظر الوظيفة المضمنة: bwconncomp).
   4. احسب متوسط المسافة بين كل فوكسل ضام في المجموعة والنقطة الوسطى الكروية (المختارة يدويا) لكل مجموعة. حدد المنطقة الكروية على أنها المجموعة ذات الحد الأدنى لمتوسط المسافة.
   5. احسب عدد الفوكسل داخل المنطقة الكروية ثم اضرب في الحجم الفعلي لفوكسل فردي (الحجم / فوكسيل) ، مما ينتج عنه الحجم الإجمالي للكروية.

5. الكشف عن منطقة الخلايا الميتة لكرويات الورم ثلاثية الأبعاد

} ملاحظة: { في وسط متجانس ، يمكن وصف شدة OCT المتناثرة الخلفية كدالة للعمق ({ ({z)) يمكن وصفها بواسطة قانون بير لامبرت:

حيث {TAG_699{TAG_700}}z {{}}{{}} {TAG_705{TAG_706}}μ} هو معامل التوهين البصري، و I0 هي شدة الحادث للعينة. ومن ثم يمكن التعبير عن معامل التوهين البصري المشتق على النحو التالي:

نظرا لأن صور OCT غالبا ما يتم رسمها على مقياس لوغاريتمي ، يمكن استرداد ميل ملف تعريف شدة OCT لاشتقاق معامل التوهين البصري. انظر الشكل 2C للحصول على مخطط انسيابي لتوليد خرائط التوهين البصري.

1. قم بإجراء التجزئة لإزالة المناطق غير المرغوب فيها خارج السكورة. قم بإجراء مرشح متوسط ثلاثي الأبعاد لقمع ضوضاء البقع المتأصلة في صور OCT.
2. احصل على معاملات التوهين البصري بالبكسل عن طريق التركيب الخطي لملف تعريف شدة OCT على نطاق عمق معين (نافذة متحركة) ، واستخراج ميله ، وضرب المنحدر في -1/2.
   ملاحظة: يتم حساب معامل التوهين عند كل فوكسل داخل المنطقة الكروية المجزأة بناء على منحدر ملف تعريف شدة OCT في نافذة عمق 10 فوكسل (~ 40 ميكرومتر في العمق) ، مع وجود voxel في منتصف النافذة.
3. قم بتطبيق الطرق المذكورة أعلاه (الخطوتان 5.1 و 5.2) على كل مسح محوري في إطار وكل إطار في مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد تحتوي على المنطقة الكروية المجزأة حتى يتم حساب معاملات التوهين البصري لجميع فوكسيل المنطقة الكروية المجزأة.
4. قم بإجراء العتبة الثنائية لتسليط الضوء على منطقة التوهين العالي.
   قم بتمييز خريطة التوهين البصري الثنائية على الصورة الأصلية لتسمية منطقة الخلية الميتة (المزج). قم بإنشاء الصورة ثلاثية الأبعاد لخريطة التوهين المختلطة لتصور التوزيع ثلاثي الأبعاد لمنطقة الخلية الميتة.

النتائج

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
نظام تصوير OCT للمجال الطيفي المخصص			{{}} تم تطويره في مختبرنا
الصمام الثنائي الفائق (SLD)	Thorlabs	SLD1325	مصدر الضوء
2×2 مقرنة الألياف المنصهرة أحادية الوضع 50:50 نسبة تقسيم		WP13500202B201
ذراع مرجع		{{}} {{}} {TAG_47}}
أنبوب العدسة	Thorlabs
Thorlabs
عدسة موازية	Thorlabs	AC080-02 0-C
عدسات التركيز البؤري	Thorlabs
Thorlabs
مرآة	Thorlabs	{{}} {{}} {TAG_107}}
1D Translational Stage	Thorlabs
Thorlabs
الركيزة	Thorlabs
شوكة لقطة	ثورلاب
عينة ذراع
أنبوب العدسة	ثورلاب
محول	Thorlabs
العدسة المكافئة	Thorlabs	AC080-020-C
Galvanometer	Thorlabs
عدسة الترحيل	Thorlabs	AC254-100-C	عدستان مرحلان لصنع تلسكوب setup
	Thorlabs
} مرآة	Thorlabs
Objective	Mitutoyo		{{ TAG_239}}
	ثورلابس
شوكة لقط
وحدة التحكم في الاستقطاب	Thorlabs		{{ TAG_269}}
جبل قفص 30 ملم	ثورلاب
قضيب قفص	Thorlabs
Stage			{{ TAG_299}}
مرحلة الترجمة الآلية ثلاثية الأبعاد	بكين ماو فنغ للإلكترونيات الضوئية والتكنولوجيا المحدودة ، Ltd.	JTH360XY
مرحلة إمالة ثنائية الأبعاد
مرحلة الدوران	{{TAG_ 325}}
حامل اللوحة			3D printed
مطياف
أنبوب العدسة	Thorlabs{{TAG_ 355}}
محول	ثورلاب
العدسة الموازية	Thorlabs	AC080-020-C
Grating	Wasatch	G = 1145 lpmm
F-theta lens	Thorlabs	FTH-1064-100
InGaAs line-scan camera	Sensor Unlimited	SU1024-LDH2
مكون ثقافة الخلية{{TAG_ 414}}
HCT 116 Cell line	ATCC	CCL-247
قارورة ثقافة الخلية	SPL Life Sciences	70025
ماصة	فيشربراند	14388100
}	سورنسون للعلوم البيولوجية	10340{TAG_459{}} }}
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
مصل الجنين البقري المعتمد من أصل أمريكي	Thermo Fisher Scientific	16000044
المضادات الحيوية-المضادة للفطريات (100X)	15240062
مرفق كورنينج 96-بئر صاف القاع الدائري المنخفض للغاية microplate	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7., 4	ثيرمو فيشر العلمي	10010023
جيبكو تريبسين-EDTA (0.5٪)	ثيرمو فيشر العلمي	15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 حاضنة	Thermo Fisher Scientific	3120
قفازات	VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich{{ TAG_555}}	P7793
نقل pipets	الكرة الأرضية العلمية	138080
{{}TAG_573}	Eppendorf	5702 R	لطرد المركزي أنبوب 15 مل
الطرد المركزي{{ TAG_583}}	NUAIRE	AWEL CF 48-R	لطرد اللوحة المكونة من 96 بئر
مجهر	أوليمبوس
{TAG_604{}}
SD-OCT system	Thorlabs	سلسلة Telesto
} نظام SD-OCT	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
Software for Data Analyses{{TAG_ 637}}
	NIH	ImageJ	تعمل فيجي أيضا.
3D rendering	Thermo Fisher Scientific	Amira	البرمجيات التجارية. الخيار 1
عرض ثلاثي الأبعاد	[TAG_669}}	Imaris	البرمجيات التجارية. الخيار 2. يستخدم في البروتوكول
برنامج اكتساب OCT			مخصص تم تطويره في C ++.
التحكم في المرحلة	بكين ماو فنغ للإلكترونيات الضوئية المحدودة	MRC_3	تم دمجها في رمز اكتساب OCT المخصص
برنامج معالجة OCT			تم تطويره حسب الطلب في C ++. استخدم وحدة معالجة الرسومات. مدمج في رمز اكتساب OCT المخصص.
التحليل المورفولوجي والفسيولوجي			تم تطويره حسب الطلب في MATLAB

{{ TAG_62}}محول{{TAG_ 92}} تركيب المرآة الحركية{{ TAG_122}}مرشح الكثافة المحايدة المستمر{{ TAG_136 5}} {{ TAG_151}}{TAG_166{ }} {{TAG_ 181}} }}{{{}}{}}{{} TAG_254 1}}Thorlabs{{}}{{}} قضيب القفص{{}}{{TAG_340} }{{TAG_ 386}} {{TAG_400 }}{{TAG_ 473}}{{TAG_486 TAG_487}}{{}}{{}}{TAG_540{}} }} } }{{ TAG_610}}