تصوير البوليسومات المعزولة من دماغ الفأر باستخدام مجهر القوة الذرية

Abstract

Source: Lunelli, L., et. al. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force الفحص المجهري. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو تصوير polysomes باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية. تقوم صفيحة الميكا المطلية بأيونات النيكل بتثبيت الحمض النووي الريبي بالريبوسومات المرفقة. يتم غسل العينة وتجفيفها وتركيبها على مرحلة المجهر. يقوم طرف الكابولي بمسح سطح العينة ، وتسجيل انحرافات الليزر لرسم خريطة الطوبولوجيا. يستخدم البرنامج لتصحيح التشوهات وتصور الهياكل المتعددة الأشكال عالية الدقة.

Protocol

تحذير: لتجنب أي تدهور للحمض النووي الريبي للعينات ، قم بإعداد جميع المخازن المؤقتة باستخدام المياه المعالجة DEPC لتقليل تلوث RNase.

1. تحضير البوليزومات من الأدمغة الكاملة

1. جمع أنسجة المخ (15 دقيقة)
   1. {{}}{TAG_31{TAG_32}} الاختناق لمدة 5 دقائق. قم بتشريح الدماغ بعناية من الجمجمة ، ثم ضع الأنسجة في أنبوب سعة 1.5 مل ، وضعها على الفور في النيتروجين السائل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. تحضير المحللة (30 دقيقة)
   1. سحق أنسجة المخ بالكامل باستخدام الهاون والمدقة تحت النيتروجين السائل.
   2. انقل حوالي 25 مجم من المسحوق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بارد وأضف 0.8 مل من محلول التحلل ( انظر الجدول 1 وتعطيل الخلية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 25 مرة بسرعة.
   3. الطرد المركزي للأنبوب عند 12,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية للحبيبات الحطام الخلوي.
   4. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واحتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة.
   5. الطرد المركزي الأنبوب عند 12,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى نوى الحبيبات والميتوكوندريا.
   6. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
   7. قم بتخزين المادة الطافية عند -80 درجة مئوية لمدة أقصاها 6 أشهر أو استخدمها على الفور.
3. تحضير التدرج السكروز والطرد المركزي (2 ساعة و 30 دقيقة)
   1. اغسل أنابيب الطرد المركزي الفائق على نطاق واسع بمياه خالية من RNase (مياه معالجة ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC-water) أو تجاري) و 3٪ H₂O₂/DEPC H_{2{{{TAG_ 126}}}O solution.
   2. ضع الأنابيب على الثلج وأضف 5.5 مل من محلول السكروز البارد بنسبة 50٪ في قاع كل أنبوب (انظر الجدول 1 لمحاليل السكروز). أضف بعناية محلول السكروز بنسبة 15٪ قطرة قطرة ، مع البقاء بالقرب من الطور البيني من أجل الحفاظ على طور بيني حاد حتى يمتلئ الأنبوب بالكامل. عندما يمتلئ الأنبوب بالكامل ، أغلقه بسدادة مطاطية لتجنب تكوين فقاعة الهواء.
   3. في غرفة باردة ، ضع الأنابيب برفق أفقيا واحتفظ بها في هذا الوضع لمدة ساعتين. بعد هذا الوقت ، قم بتصويب الأنابيب ببطء مرة أخرى إلى الوضع الرأسي وضعها على الجليد. التدرجات جاهزة الآن للاستخدام. بدلا من ذلك ، قم بإعداد تدرج السكروز بنسبة 15-50٪ باستخدام تدرج تقليدي سابق.
   4. في غرفة باردة ، قم بإزالة 1.0 مل بعناية من أعلى التدرج وتراكب السكروز قطرة قطرة مع المحلل الخلوي (أي المادة الطافية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2).
   5. قم بخفض الأنابيب بعناية في دلاء دوار الجرافة المتأرجح. قم بالطرد المركزي للتدرجات لمدة 100 دقيقة عند 180,000 × جم عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي فائق.
   6. بعد الطرد المركزي، اترك الأنابيب في جرائها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتثبيت التدرجات.
4. تجزئة التدرج السكروز (2 ساعة)
   1. قم بإزالة أنبوب طرد مركزي فائق بعناية من دوار الطرد المركزي الفائق وقم بتثبيته على جهاز التجميع لنظام تجزئة التدرج الكثافة. اجمع كسور 1 مل لمراقبة الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية / المرئية (انظر الشكل 1 اللوحة العلوية). احتفظ بالكسور المجمعة على الجليد.
   2. قم بإعداد حصص من 30-40 ميكرولتر من الكسور ذات الاهتمام. احتفظ بها على الثلج قبل تخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تستخدم الحصص أو الكسور السكروز التي خضعت لأكثر من دورتين للتجميد والذوبان (انظر الشكل 1 اللوحة السفلية).

2. عينة تحضير للفحص المجهري للقوة الذرية (3 ساعات)

1. باستخدام شريط لاصق ، انزع صفائح الميكا.
2. اغسل رقائق الميكا 3-4 مرات بماء DEPC وضعها في طبق بتري صغير. ثم جفف السطح باستخدام الهواء.
3. قم بتغطية الميكا ب 200 ميكرولتر من 1 ملي NiSO₄ واحتضن لمدة 3 دقائق في RT.
4. قم بإزالة محلول النيكل ثم جفف السطح باستخدام الهواء. نفذ جميع الخطوات المستقبلية عند 4 درجات مئوية عن طريق وضع طبق بتري مع الميكا على الثلج.
5. قم بإذابة كمية تم الحصول عليها في 1.4.2 على الجليد وأضف برفق كل العينة قطرة قطرة إلى الميكا. باستخدام طرف 100-200 ميكرولتر ، انشر العينة على كامل سطح الميكا. احتضن العينة على الجليد لمدة 3 دقائق.
6. قم بتغطية ورقة الميكا قطرة قطرة ب 200 ميكرولتر بارد Buffer-AFM الجدول 1) واحتضنه لمدة ساعة واحدة على الجليد.
7. التصوير في السائل
   1. {{}} بعناية قم بإزالة مجهر القوة الذرية العازلة (AFM) بعناية واغسل أوراق الميكا 3-4 مرات باستخدام 200 ميكرولتر بارد Buffer-AFM لإزالة السكروز الزائد. بعد ذلك ، اغسل أوراق الميكا 3 مرات بمحلول غسيل بارد (انظر الجدول 1 ) ، مع ترك سطح الميكا مغطى ببعض الميكرولترات من المحلول.
   2. انتقل إلى النقطة 3 (الحصول على الصور).
8. التصوير في الهواء
   1. قم بإزالة Buffer-AFM بعناية واغسل الميكا 3-4 مرات باستخدام 200 ميكرولتر بارد Buffer-AFM لإزالة السكروز الزائد. بعد ذلك ، اغسل الميكا 3 مرات بمحلول الغسيل البارد (انظر الجدول 1 ) واستنزف الماء الزائد باستخدام الورق.
   2. اترك العينة لتجف تحت الغطاء الكيميائي مع فتح الجزء العلوي من طبق بتري جزئيا. بعد ساعتين ، أغلق طبق بتري واحفظه في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بقياس العينة بعد 2-3 ساعات ، لأنها مستقرة لسنوات.

3. الحصول على الصور (15 دقيقة لكل صورة بعد التثبيت الحراري)

} ملاحظة: يمكن تصوير البوليزومات المثبتة على الميكا في الهواء أو في السائل باستخدام وضع التيار المتردد.

1. قم بتوصيل الميكا بحامل العينة باستخدام شريط لاصق على الوجهين.
2. أدخل حامل العينة في مرحلة AFM باتباع إرشادات الشركة المصنعة. عند التصوير في السائل ، إذا أمكن ، حاول الحفاظ على العينة عند درجة حرارة أقل من 25 درجة مئوية لزيادة ثبات البوليسومات في الوقت المناسب.
3. حدد ناتئا مناسبا لتصوير التيار المتردد وقم بتثبيته على حامل الطرف باتباع إرشادات الشركة المصنعة. هنا ، استخدم الكابولي بقوة ثابتة بين 2-20 نيوتن / م للتصوير الجوي وحوالي 0.1 نيوتن / م للتصوير السائل.
4. اضبط بقعة الليزر على الكابولي وقم بتصفير إشارات كاشف الربع.
5. حدد تردد القيادة المناسب وقم بقيادة الكابولي بسعة 10-20 نانومتر.
6. اقترب من العينة حتى يشبك الطرف السطح.
7. حدد منطقة مسح ضوئي بحجم 2 × 2 ميكرومتر، واحصل على صور بحجم 512 × 512 بكسل على الأقل (عرض البكسل < 4 نانومتر)، وحدد وضع طرح الخلفية الحية ومقياس Z من 20 إلى 25 نانومتر.
8. افحص الصورة بحثا عن وجود أجسام مستديرة تتميز بالارتفاع بين 10 و 15 نانومتر عند الاستحواذ في الهواء و 25 و 30 نانومتر عندما تكون في السائل والعرض في النطاق 25-30 نانومتر. اضبط معلمات نقطة الضبط والتغذية الراجعة حتى يتم تصور الكائنات الحادة. يجب أن تظهر الخلفية مسطحة نسبيا في العينات الجيدة ، مع بعض الكائنات التي يبلغ ارتفاعها 2-4 نانومتر (انظر الشكل 2A و B ).
9. إذا كانت الصورة تبدو جيدة (كما هو موضح في النقطة 3.8) ، فاحصل على عدة (على الأقل عشرة) عمليات مسح 2 × 2 ميكرون في مناطق عينة مختلفة.
10. (اختياري). إذا لزم الأمر، احصل على صور عالية الدقة لمجموعات متعددة الأشكال المحددة (انظر الشكل 2C).
11. قم بتطبيق تصحيحات البرامج (خوارزميات الطرح المستوي والتصحيح سطرا بسطر) لتصحيح صور AFM ، وإزالة تأثيرات الإمالة والانجراف التعسفية.

4. تحليل البيانات (30 دقيقة لكل صورة)

1. تصدير الصور في ImageJ (اختياري: تطبيق عامل مقياس) بشكل تفضيلي باستخدام تنسيق ضغط بدون فقدان البيانات، على سبيل المثال، تنسيق TIFF (انظر الشكل 3A).
2. استخدم مجموعة أدوات الماكرو ImageJ RiboPick.ijm (ليتم نسخها في الدليل الفرعي لماكرو / مجموعة أدوات ImageJ) لحساب الريبوسومات في polysomes (انظر الشكل 3B ) واحسب الخصائص الإحصائية للعينة (انظر الشكل 3C ).
   1. ابدأ في تحميل صورة باستخدام أداة <قراءة الصورة> التي تقوم بتهيئة البرنامج.
   2. اختر مراكز الريبوسوم باستخدام أداة ImageJ القياسية <تحديد النقطة> (يسمح shift + بزر الماوس الأيسر بالتحديد المتعدد للريبوسومات). ضع علامة على الريبوسومات المحددة باستخدام أداة <mark>. ستظهر إحداثيات الريبوسوم في نافذة نصية مخصصة.
   3. أضف المزيد من الريبوسومات إلى نفس البولي سوم ، وكرر الإجراء المشار إليه في النقطة 4.2.2.
   4. قم بإزالة الريبوسومات التي تم وضع علامة عليها بشكل خاطئ باستخدام أداة <التراجع عن الانتقاء الأخير> (ابدأ في الإزالة من آخر ريبوسوم مضاف إلى الأول - في تعدد الجسيمات الحالي فقط).
   5. عند اكتمال polysome ، استخدم أداة . عندما تتم إضافة رقم متعدد الأشكال كتراكب إلى الصورة ، يتم تحديث نافذة النص.
   6. استخدم <حفظ النتائج والإغلاق> لكتابة ملف إحداثيات الريبوسوم (يتم استخدام الوحدات الافتراضية للصورة) وصورة PNG التي تلخص الريبوسومات المختارة وتعدد الجسيمات. الصورة الأصلية مغلقة دون حفظها.

الجدول 1. المخازن المؤقته.

10 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.00. 5

Buffer	التكوين	} التطبيق
	تحضير المحللة (1.1)
	{ {{TAG_571}TAG_572}{{}}	{{{TAG_ 577}}
	{{TAG_585}TAG_586}2{{TAG_590 TAG_591}} {
	{{}}
	1٪ Na-deoxycholate{
	0.0. 4 U/ml RNase Inhibitor
{{ TAG_641}}	1 ملم DTT
	0.2 ملغ/مل سيكلوهكسيميد
	{{ TAG_673}}5 U/ml Dnase I
50٪ محلول السكروز{{TAG_687 }}	50٪ (w/v) السكروز في	}السكروز تحضير التدرج (1. 2)
	{{TAG_713}TAG_714}{{}} {{TAG_717 }}
	2{{ TAG_733}}
	10 ملي مولار تريس / حمض الهيدروكلوريك 7.00 5
	{{ TAG_764}}15٪ (w/v) السكروز في	تحضير التدرج السكروز (1.1.) 2)
	{{TAG_785}TAG_786}
2
	10 ملي مولار تريس/حمض الهيدروكلوريك 7.00. 5
	{ {{TAG_837 TAG_838}}{{}}4	عينة التحضير ل AFM (2)
Buffer-AFM	{{TAG_869}TAG_870}	{TAG_877}}{{}}{{}} عينة من التحضير ل AFM (2)
	{TAG_890{TAG_891}} {{}}{{}}{{}}{{}}2
	100 ميكروغرام/مل سيكلوهكسيميد{
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
	{{TAG_935 TAG_936}}{{}} الرقم الهيدروجيني = 7. 4
الغسيل الحل	DEPC-Water	عينة التحضير ل AFM (2)
	{{}TAG_982} {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}{{}}{}}{}}{}}{{ TAG_610}}{{ TAG_794}} {{ TAG_824}}

Results

Materials