التصوير المزدوج الفلوري لتحديد الخلايا قليلة التغصن المتمايزة

الملخص

Source: Schott ، JT ، et al. تحضير ثقافات سلف الخلايا قليلة التغصن للفئران والقياس الكمي لتكوين الدبقية قليلة التغصن باستخدام المسح الضوئي المضان بالأشعة تحت الحمراء المزدوجة. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو استخدام التصوير المضان المزدوج لتقييم تمايز الخلايا قليلة التغصن عن الخلايا السليفة (OPCs) معزولة عن دماغ جرو الفئران. تتضمن العملية إصلاح الخلايا ، ووضع علامات على علامات محددة بالأجسام المضادة الثانوية الأولية والمرافقة بالفلوروفور ، وتصورها باستخدام التصوير الفلوري. يتم تحديد الخلايا قليلة التغصن المتمايزة التي تعبر عن كل من بروتين المايلين الأساسي (MBP) وعامل نسخ الخلايا قليلة التغصن 2 (Olig2) ، مما يميزها عن الخلايا السليفة غير المتمايزة التي تعبر عن Olig2 فقط.

البروتوكول

1. إعداد لوحات الفحص ، وحلول المخزون ، ووسائط OPC الأساسية

ملاحظة:

repensize poly-L-lysine (PLL) إلى تركيز 10 ميكروغرام/مل في ماء معقم منزوع الأيونات. ماصة 400 ميكرولتر من PLL المخفف في كل بئر من طبق ثقافة الأنسجة 24 ذو الجدران السوداء والشفاف.

N-Acetyl-L-cysteine (NAC) محلول مخزون (1,000x): يذوب 100 ملغ N-Acetyl-L-cysteine (NAC) في 20 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.

< نمط الامتداد = 'لون الخلفية: شفاف ؛ اللون: # 000000 ؛ ' > تحضير محلول مخزون البروجسترون (25 ميكروغرام/ميكرولتر): قم بإذابة 2.5 ملغ من البروجسترون في 100 ميكرولتر من الإيثانول.

2. تحريض تمايز OPC وتثبيته مع 4٪ Paraformaldehyde

ملاحظة:

pre-warm opc base media to 37 °C وإذابة مخزون العلاج بالمخدرات إلى درجة حرارة الغرفة. عند إجراء العلاجات بشكل متكرر ، قم بإعداد ما يقرب من 1.25 مل من الوسائط لكل مجموعة علاج في أنبوب سعة 1.5 مل. بالنسبة للعينات الثلاثية ، استخدم أنابيب الطرد المركزي بسعة 2 مل لحساب الركود.

₃₃ ⁺ CAUTION:^{2 +} < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ > و Mg²⁺3. Immunocytocell والقياس الكمي لبروتين المايلين الأساسي

ملاحظة:

bring the plate to the room-temperature, send the well-swell, and add 250 μl of D-PBS (مع Ca^{2 +} و Mg²⁺) تحتوي على 0.1٪ Triton X-100 و 5٪ مصل ماعز عادي (NGS). احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مداري لطيف.

²⁺ and Mg²⁺) تحتوي على 5٪ NGS. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مضاد Olig2 متعدد النسيلة للأرانب عند 1: 1,000 للتطبيع المحدد لخلايا الدبقية قليلة التغصن في الثقافات الدبقية المختلطة. قم بإعداد محلول أولي كاف لاستيعاب 250 ميكرولتر لكل بئر.

^{2 + 2+}) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مداري لطيف. style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;عائلة الخط:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>²⁺ and Mg²⁺) تحتوي على 5٪ NGS. قلل من التعرض للضوء المحيط عند تحضير هذا المحلول.

^{2 + 2+}) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مداري لطيف. style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;عائلة الخط:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>

باستخدام البرنامج، اضبط وضع تحليل اللوحة على "24 Well" وقم بمحاذاة الدوائر حول المحيط الخارجي للآبار الممسوحة ضوئيا. اضبط قناة التطبيع على "800" وقم بتصدير شدة التألق الإجمالية والنسبية لقناتي 700 نانومتر (MBP) و 800 نانومتر (Olig2 / Actin).

المواد

<فئة الشكل = 'جدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: ثابت ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets-root = '1' data-sheets-baot = '1' >style = 'width: 25٪;' width = '306'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Culture MaterialsPDGF-AAPeproTech Inc100-13A20ng/mLdimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2650Hybri-Max 100 mL< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Triiodothyronine Sigma-AldrichT639745 nMClemastine fumarate saltSigma-AldrichSML0445-100MG1 μMQuetiapine hemifumarate saltSigma-Aldrich<td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Q3638-10MG1 μMN-acetyl cysteineSigma-AldrichA9165<td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>5 μg / mLProgesteroneSigma-AldrichP8783< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>60 ng/mLPoly-L-lysineSigma-AldrichP152410 μg / mLPutrecineSigma-AldrichP750516 μg / mL Sodium SeleniteSigma-AldrichS526140 ng/mLHydrocortisoneSigma-AldrichH013550 ng/mLd-BiotinSigma-AldrichB4639< td style = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛'>الأنسولين < td النمط = 'الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> Sigma-Aldrich < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom;'>I66345 μg / mLApo-TransferrinSigma-AldrichT1147100 μg / mL Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4161100 μg / mLTrace Elements BCorning25-022-Cl1 x B-27 SupplementLife Technologies175040441 x Penicillin/StreptomycinLife Technologies151401221 x DMEMLife Technologies11995-0651 x -24-well Black Visiplate with coverPerkin Elmer1450-605Pattern Culture Grade Immunocytocytochemistry and QuantificationPFASigma-Aldrich100-13A4٪Triton X-100Sigma-Aldrich787870.10٪Normal Goat SerumJackson Immuno Research005-000-1215٪ monoclonal anti-MBPBiolegendSMI-99P< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>1:1000 Dilutionrabbit polyclonal anti-ActinSanta Cruz BiotecnologySC-72101:200 Dilutionالأرنب متعدد النسيلة مضاد للأوليغ 2 < td النمط = 'الفائض: مخفي ؛ الحشو : 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛'>Millipore < td style = 'overflow: hidden ؛ padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>AB9610 < td style = 'overflow: hidden؛ padding: 0px 3px؛ vertical-align: bottom;'>1: 1000 Dilutiongoatgoat anti-mouse 680RDLicor926-680701:500 Dilutiongoatgoat anti-rabbit 800CWLicor926-322111:500 DilutionAlexa Fluor 594 goat oy-mouse styleLife TechnologiesA110321:000 dilutionAlexa Fluor 488 goat goat anti-rabbitLife TechnologiesA11008< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>1:000 dilution إطالة الذهب المضاد للتلاشي مع DAPILife TechnologiesP36931 DPBS with Ca2+ and Mg2+Corning21-030-CV< td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> Licor Odyssey Clx Infared Imaging SystemLicor