تصور الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية داخل البشرة

الملخص

المصدر: حميد، ح. س.، {{}}. تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية داخل البشرة البشرية. J. Vis. Exp. (2017)

} يوضح هذا الفيديو طريقة تصور الميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد. يحدد عملية الحصول على فحوصات متسلسلة للألياف العصبية داخل البشرة المسبقة وتوليد صور سطحية ثلاثية الأبعاد لعزل الميتوكوندريا وعرضها فيما يتعلق بالهياكل العصبية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد. style='line-height:1.2;margin-bottom:12pt;margin-top:12pt;' dir='ltr'>1. التصوير متحد البؤر

1. Perform imaging-confocal style:
   1. جمع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مع غمر الزيت 40X (فتحة عددية 1.25 (NA)) على مجهر مقلوب. style='هامش أسفل:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
   2. في كل مستوى بؤري, الحصول على إشارات الفلورسنت بالتتابع:
      الميتوكوندريا: الإثارة λ = 543 نانومتر، مرشح الانبعاث الطيفي λ = 606 - 670 نانومتر
   style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>
2. اضبط برنامج المجهر للحصول على دقة جانبية محسنة (دقة المسح = 1,024 × 1,024) والدقة المحورية / التقسيم البصري (فتحة متحد البؤر = 1 وحدة جيدة التهوية (AU) بحجم خطوة z يبلغ 210 نانومتر).
   ملاحظة: دقة XYZ الناتجة هي 172.2 نانومتر × 172.2 نانومتر × 210 نانومتر مع حجم صورة 176.1 ميكرومتر × 176.1 ميكرومتر × 30-50 ميكرومتر.

ملاحظة: تستغرق أوقات المسح باستخدام المعلمات المذكورة أعلاه حوالي 20-40 دقيقة، اعتمادا على عدد شرائح z.

2. 3D تصور وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية البشرية داخل

البشرة

1. Isolate the 3D epidermis:
   1. تكرار الصورة الأصلية واستخدم الإسقاط الأقصى للكثافة (عرض التركيز الموسع) للصورة لتحديد البشرة وعزلها. style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>استخدم deconvolution على إشارات الفلورسنت العصبية والميتوكوندريا:
      يساعد إزالة الالتفاف على استعادة سلامة إشارات الفلورسنت. تسمى الاستعادة المستخدمة في هذا البروتوكول بإزالة الالتفاف الأعمى لأنها تستخدم إشارات الفلورسنت في الصور لتحديد مقدار انتشار الإشارات من مصدرها الأصلي (وظيفة انتشار النقاط). تعمل العملية على تحسين دقة الإشارة عن طريق إعادة تعيين انتشار الإشارة إلى موقعها الأصلي.
      1. احسب دالة انتشار النقطة (PSF) للإشارة العصبية الفلورية الخضراء (المضان الأخضر) مع المعلمات التالية:
         1. قم بتعيين PSF المحسوب على confocal. اضبط معامل الانكسار المتوسط على 1.515 والفتحة العددية على 1.25. اضبط ثقب الكاشف على 1 وحدة فلكية. اضبط الطول الموجي للإثارة بالليزر على 543 نانومتر والطول الموجي للانبعاث على 617 نانومتر.
      2. إنشاء أسطح خاصة بالعصب:
         1. استخدم أداة "إنشاء سطح" لعمل سطح صلب للأعصاب من الملصقات الثانوية الفلورية الخضراء غير الملتوية لمنتج جين البروتين 9.5 (PGP9.5) التي تم تحديدها. style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'> ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بتحرير الأسطح الإضافية غير العصبية يدويا داخل علامة التبويب "تحرير" عن طريق الضغط على مفتاح CONTROL لتمييز كائنات متعددة ثم حذفها باستخدام مفتاح Delete.
         style='لون الخلفية:شفاف;اللون:#00000;عائلة الخط:Arial,sans-serif;حجم الخط:12pt;نمط الخط:عادي;متغير الخط:عادي;حجم الخط:عادي;حجم الخط:400;نوع نمط القائمة:عشري;زخرفة النص:لا شيء;محاذاة عمودي:خط الأساس;'المسافة البيضاء:pre;' dir='ltr' aria-level='1'>عزل إشارة الميتوكوندريا الفلورية الخاصة بالأعصاب:
         1. select the edit tab of the upper surface to view "Mask Properties". يستخدم سطح العصب الذي تم إنشاؤه لعزل الميتوكوندريا داخل تلك الأعصاب بعيدا عن إشارات الميتوكوندريا المرتبطة بالخلايا الكيراتينية.
         2. إنشاء أسطح خاصة بالميتوكوندريا:
            1. استخدم أداة "إنشاء سطح" لعمل سطح صلب للميتوكوندريا من قناة الفلورسنت التي تم إنشاؤها حديثا لإشارات الميتوكوندريا الخاصة بالعصب. style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>NOTE:

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Leica SP5 مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
Volocity x64 software	Perkin Elmer, Waltham , MA	Version 4.4.0	{{}} يستخدم برنامج Volocity لمعالجة الصور
Imaris x64 3D analysis software{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	Version 7.7.1	يستخدم برنامج Imaris لتحليل الصور