تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي لدراسة استجابات ذبابة الفاكهة للدماغ للببتيدات العصبية

الملخص

المصدر: Ishimoto, H. }et. al.،، تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي لتصور استجابات الدماغ لإشارات الغدد الصماء في ذبابة الفاكهة. J. Vis. Exp. (2018)

} يوضح هذا الفيديو تصوير الكالسيوم للدراسةذبابة الفاكهة استجابات الدماغ للببتيدات العصبية. تكشف الخلايا العصبية التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم الفلوري عن ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا والاستجابات الوظيفية لجزيئات الإشارات.

البروتوكول

1. تحضير استخلاصات اليرقات للدماغ

1. make a imaging chamber.
   NOTE:^{2 +} < نمط الامتداد = 'عائلة الخط: Arial ، sans-serif ؛ حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس ؛ المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ نظام التصوير >.
   1. باستخدام ملقط، خدش المركز السفلي لطبق استزراع بلاستيكي (35 مم × 10 مم) لإحداث انبعاج للعقدة البطنية لدماغ اليرقات، مما يجعل التركيب أسهل (الخطوة 1.3، الشكل 1). style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>الشكل 1NOTE:^3-), pH 7.4 ± 0.05 عند 25 °C).
2. ملاحظة: UAS-GCaMP6s. لضمان التوسط في الإشارة من خلال المستقبل المرشح ، يتم التعبير عن GCaMP6s أيضا في عيب متحور في المستقبل.
   1. عندما تكون هناك حاجة إلى مقارنات تجريبية لأنماط وراثية مختلفة مثل النوع البري والطفرات ، فإن مطابقة العمر تختبر اليرقات لتجنب الاختلافات في مستوى التعبير GCaMP6 والاختلافات الفسيولوجية بسبب مراحل النمو. style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>
   2. تشريح الدماغ اليرقي
      1. بعد 90-120 ساعة من وضع البيض (AEL) ، اجمع اليرقات واغسلها 3 مرات على الأقل بالماء المقطر لإزالة بقايا الطعام الملتصقة. style='لون الخلفية:شفاف;اللون;color:#00000;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;list-style-type:decimal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre;' dir='ltr' aria-level='2'>NOTE:NOTE: بدلا من ذلك, يمكن استخدام المقص الجراحي.
      3. Setting the brain in the imaging chamber
         1. الشكل 1).

      2. Acquisition of Ca²⁺ Fluorescence Images

      NOTE: يتم تصوير مكثفات الدماغ المغمورة في PBS باستخدام مجهر مضان مزود بعدسة موضوعية غمر الماء 20X (فتحة عددية, NA = 0.5). لا ينشط PBS الخلايا في الدماغ. إذا كانت هناك حاجة إلى صور المحور Z ، يتم تركيب العدسة الموضوعية مع محرك عدسة يتم تنشيطه بالكهرباء الضغطية. يتم استخدام رأس متحد البؤر للقرص الدوار لتحسين دقة الوقت. للتصوير في الإضاءة المنخفضة ، يتم تثبيت كاميرا جهاز مقترن بالشحنة بضرب الإلكترون على المجهر. يتطلب تصوير مضان GCaMP6s (الإثارة / الانبعاث: 488/509 نانومتر) ليزر 488 نانومتر للإثارة باستخدام مقسم شعاع ثنائي اللون ومرشح انبعاث (e.g<span style='font-family: Arial,sans-serif; حجم الخط: 12pt ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ وزن الخط: 400 ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. المساحة البيضاء: التفاف مسبق ؛ >.، 528 ± مرشح ممر النطاق 38 نانومتر).

      1. ضع غرفة التصوير التي تحتوي على نبتة الدماغ تحت المجهر.
      2. NOTE: the basal green يجب أن يكون مضان GCaMP6s مرئيا.
      3. على سبيل المثال NOTE:dilp2>GCaMP6s. عندما تكون المقاطع z مطلوبة لعمق تصوير معين، يمكن الحصول على العديد من صور المقطع z اعتمادا على وقت التعرض وفترات الإطار. إذا كانت الكاميرا تحتوي على دقة مكانية كافية، فيجب زيادة حجم التجميع (عدد السجلات الموجودة على الشريحة التي سيتم تجميعها في بكسل رقمي واحد) لتقليل وقت التعريض الضوئي.
      4. ₀ملاحظة: الببتيد يجب حقن المحلول ببطء (e.g.

النتائج

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize' النمط = 'collapse border: collapse ؛ font-family: Calibri ؛ حجم الخط: 11pt ؛ تخطيط الجدول: fixed ؛ 'cellpacing = '0' cellpadding = '0' dir = 'ltr' border = '1' data-sheets-root = '1' data-sheets-baot = '1'>style = 'width: 25٪;' width = '203'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قضيب التنغستنأنظمة A-M, Sequim, WA, USA < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ > بلو تاك بوستيك, باريس, فرنسا3049100المواد اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام الشبيهة بالمعجون < نمط tr = 'الارتفاع: 20 بكسل ؛ '>< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> زجاج الساعة ، مربع ، 1 5/8 بوصة < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص:center; المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >شركة كارولينا للتوريد البيولوجي ، برلنغتون ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> 742300 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> نمط PBSشركة تاكارا بيو ، كوساتسو ، شيغا ، اليابان < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> T900 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >الأملاح المخزنة الفوسفاتية CCHa2 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> الببتيد المركب Custum Ghrerinمعهد الببتيد ، أوساكا ، اليابان < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> 4372-s< td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ '> < td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;عائلة الخط:Arial;حجم الخط:10pt;وزن الخط:عادي;الفائض:مخفي;الحشوة:0px 3px;المحاذاة الرأسية:أسفل;المساحة البيضاء:عادي;التفاف الكلمات:break-word;wrap-strategy:4;'>Nociceptin 4313-v Axio Imager A2< td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Carl Zeiss, Oberkochen, GermanyFluorscope Fluorscopeالهدف W N-Achroplan 20x / 0.5 M27 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> كارل زايس ، أوبركوتشين ، ألمانيا < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص:center; المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >420957-9900-000عدسة موضوعية الغمر في الماءP-725 PIFOC الماسح الضوئي الموضوعي مع نطاق سفر طويل < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كسر الكلمة ؛ التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ '> Physik Instrumente GmbH & Co. KG ، كارلسروه ، ألمانياN/A< td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'> Tضغطية المحرك العدسات المنشط وحدة الماسح الضوئي متحد البؤر CSU-W1CSU-W1 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >رأس قرص دوارة متحد البؤرImagEM C9100-13C9100-13 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >EM-CCD cameraOBIS 488 nm LS 60 mW1178770 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >488 نانومتر ليزر< td style='لون الخلفية:#ffffff;اللون:#1a202c;font-family:Arial;حجم الخط:10pt;وزن الخط:عادي;الفائض:مخفي;الحشوة:0px 3px;المحاذاة الرأسية:أسفل;المساحة البيضاء:عادي;التفاف الكلمة:break-word;التفاف استراتيجية:4;'>488/568/647 نانومتر يوكوجاوا ثنائي اللون beamsplitterDi01-T405 / 488/568 / 647-13x15x0.5 < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >مقسم شعاع ثنائي اللون < نمط tr = 'الارتفاع: 20 بكسل ؛ '>< نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '> 528/38 نانومتر مرشح ممر النطاق الترددي أحادي النطاق BrightLine< نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص:center; المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >سيمروك ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض : مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص: المركز ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>FF01-528 / 38-25 < نمط td = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ >مرشح الانبعاث < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial ؛ حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض الزائد: مخفي ؛ الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛ المساحة البيضاء: عادي ؛ التفاف الكلمات: كلمة فاصلة ؛ استراتيجية التفاف: 4 ؛ '>μManager < td style = 'لون الخلفية: #ffffff ؛ اللون: #1a202c ؛ عائلة الخط: Arial; حجم الخط: 10pt ؛ وزن الخط: عادي ؛ الفائض: مخفي. الحشو: 0 بكسل 3 بكسل ؛ محاذاة النص:center; المحاذاة الرأسية: أسفل. المساحة البيضاء: عادي. التفاف الكلمات: كلمة فاصلة. التفاف الاستراتيجية: 4 ؛ > فتح التصوير ، شركة< td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;boardding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>N / Ahttps://micro-manager.org